编者按

在过去的十年中，基于行为学研究的神经科学得到了迅速的发展，调控行为的神经模式的进展得益于光遗传学的发现。光遗传学（将编码光活化离子电导调节器或视蛋白的单个基因导入神经元中）可在遗传、解剖学和时间尺度上进行精确调节，以确定调控的神经元群体和相关投射在行为学中的作用。与药理学和基于病理的的干预手段不同，光遗传学在行为学研究中可以方便的确定环路与行为的因果关系，并在时间尺度上做到开关效应。光遗传学甚至能结合动物的行为范式或生理活性的特性做到系统的闭环调节。小编在这里给大家推荐Kim CK等发表在《nature reviews neuroscience》题为“Integration of optogenetics with complementary methodologies in systems neuroscience”的综述，该文总结了过去十年光遗传学的研究进程，并展示了光遗传学与其他神经科学技术平台整合的方式。如结合细胞特异启动子及cre/loxp系统，当视蛋白表达在特异性的细胞后，视蛋白可沿着轴浆运输进行扩散，形成跨越两个脑区的神经投射标记。此时在特异性细胞的胞体或轴突末梢进行光遗传学激活视蛋白，均能引起神经元及下游神经元的反应；在体电生理记录过程中，运用光遗传学方式激活或抑制神经元，研究神经元电活动，环路的电生理变化和行为学的相关性；光纤钙成像结合光遗传学还可以研究不同光刺激响应幅度下，自然奖赏的奖励响应模式等。

一、自然状态和工程化视蛋白的开发

在最早调控神经活性与行为研究的实验中，微生物的视紫红素蛋白质是运用最为有效的光活性离子通道，在光控条件下，能有效的调节神经元活性。在随后的研究中发现编码视蛋白的不同基因亚型，可引发神经元的兴奋或抑制作用。例如ChRs是非特异性的阳离子通道，蓝光激发后引起神经元去极化，而eNpHR是氯离子通道，可被黄绿光激发引起神经元超级化。

在光遗传学的应用过程中，自然状态下的视蛋白均存在明显的缺点。例如光诱发效率不高，信号不强，无法做到即时的开关效应等。因此运用工程学的方式进行视蛋白结构的改进，提供更有效和更强大的光调节工具成为升级光遗传学有效途径。目前工程化的视蛋白包括，更快失活的ChRs变体（ChETA、ChIEF、Chronos等）；提升视蛋白稳定性的SSFO、SwiChR等；改变激发光波长的视蛋白VChR1、C1V1、ReaChR、Chrimson、bReaCHES等。

二、细胞特异性的视蛋白表达

运用病毒载体和cre依赖表达的重组酶系统，是将视蛋白表达到特定细胞类型最常见方案。研究往往会首先用特异性的启动子将Cre酶表达到特定的细胞类型，例如钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶II类亚单位-α启动子（CAMKIIα）高表达在兴奋性细胞中，胶质纤维酸性蛋白启动子（GFAP）高表达星形胶质细胞，髓鞘碱性蛋白质（MBP）的启动子高表达于少突胶质细胞。缺乏细胞特异性启动子的细胞类型，可以通过构建转基因鼠，将cre重组酶表达在特异性的细胞类型中。

三、投射的环路的调节

当视蛋白表达在特异性的细胞后，视蛋白可沿着轴浆运输进行扩散，形成跨越两个脑区的神经投射标记。此时在特异性细胞的胞体或轴突末梢进行光遗传学激活视蛋白，均能引起神经元及下游神经元的反应。使用犬腺病毒（CAV）在投射的下游神经元进行注射，通过逆轴浆运输到上游的胞体中，也是神经科学常用的投射标记与调节的手段。

若要将视蛋白跨突触进行表达，可采用H129株的单纯疱疹病毒（HSV）作为病毒载体，该病毒能顺行跨一级突触进行传递，但由于该病毒具有较大的细胞毒性，限制了该病毒的使用。

图1. 视蛋白结合Cre重组酶特异性标记的细胞类型和环路

四、电生理和光遗传学的结合

膜片钳电生理技术是记录神经元电活动的金标准，但是其很难与在体的行为学数据相联系。并且传统的电生理记录也难以定义特定的细胞类型。而光遗传学和在体电生理的结合能很好的解决以上两个问题。例如在体电生理记录过程中，运用光遗传学方式激活或抑制神经元，研究神经元电活动，环路的电生理变化和行为学的相关性。

光遗传学和电生理的结合还可以形成闭环模式，例如癫痫患者通常出现神经元放电异常增加，通过电生理记录神经元的电活动，当神经元放电异常增加时，触发光遗传学的开关，发射出黄色的激发光，抑制神经元的电活动，因此形成一个神经元活性的闭环调节系统。

图2. 在体电生理和光遗传学的整合

五、光遗传学与基因编码钙指示剂的结合

在行为学过程中，运用电生理记录多基因特异性表达的神经元存在很大难度，但是使用基因编码的Ca2+指示剂（GECIs）可以在细胞分辨率的基础上长期记录不同基因定义的神经元活性与行为学的相关性。目前许多研究机构将GECI和光遗传学结合进行互补，研究脑中的神经环路。例如使用光纤钙成像鉴定出决策行为期间NAc脑区活性差异的D2R神经元，然后在决策期间通过光遗传学改变D2R神经元的活性，研究是否对决策行为产生影响。此外光纤钙成像结合光遗传学还可以研究不同光刺激响应幅度下，自然奖赏的奖励响应模式。光遗传学和钙指示剂还可以和双光子相结合，将红色激发光激活的视蛋白C1V1和GCaMP6共表达在CA1神经元上，可以在双光子钙成像的过程中激活C1V1，研究细胞动力学的变化特点。

图3. 光遗传学和光纤钙成像的结合

六、光遗传学当前的限制和未来的方向

光遗传学实验的设计和数据的解读必须要考虑当前的限制因素，例如在选择视蛋白的时候，要考虑其动力学特征，一些较高光敏感的视蛋白也具有失活慢的动力学特点。视蛋白光谱重叠较大、抑制性通道光诱导效率较低，以及轴突中激活氢离子泵会增加神经递质的自发释放比例等问题仍需要解决。通过遗传学手段进行视蛋白工程化的结构学调整，是目前光遗传学局限性的潜在解决方案。

特异性标记和操作神经元的需求表明光遗传学仍将会持续高速增长。光遗传学新的机会可能会出现在定向进化产生多样化的AAV病毒和G糖蛋白缺陷的狂犬病毒。视蛋白更高特异性的表达有效方案是结合不同的重组酶系统，例如Cre、Flp和VCre，以高度特异性的方式揭示其他方案无法观察到的神经元活性与行为学直接的效应关系。通过工程化视蛋白的开发和利用，以及光遗传学结合其他神经科学平台的不断优化，光遗传学仍会继续在环路与行为相关研究中提供新的发现。

图片来源：Nature Reviews Neuroscience

原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5708544/pdf/nihms868532.pdf

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