一、重组腺相关病毒原理

腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）属于细小病毒科（parvoviridae），病毒颗粒无包膜，结构为直径约 20nm 的正二十面体，是迄今发现的一类结构最简单且无法自主复制的线性单链 DNA 病毒，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染力。通过人工进化的方法对 AAV 衣壳蛋白 Cap 基因进行定向突变改造，可以筛选到具有高转导效率和不同感染特性的 AAV 载体，极大增加了 AAV 的应用潜力。

研究中采用的重组腺相关病毒（Recombination adeno-associated virus，rAAV）载体是在非致病的野生型 AAV 的基础上改造的基因表达载体，具有种类多样、免疫原性低、安全性高、宿主范围广、扩散能力强、体内表达外源基因时间长等特点，已被广泛的应用在动物水平的基因表达、基因操作和基因治疗。
rAAV 所包含的 DNA 一般是用外源基因表达元件替换 AAV 的编码基因，仅保留了病毒复制和包装所需的 ITR 序列。通过反式补偿 Rep 基因、Cap 基因和辅助病毒功能因子包装产生携带外源 DNA 的 rAAV。AAV 的总包装容量是 4.7kb，目的基因长度要求不超过 3.5kb。

二、注射方法

总体上包括静脉注射、心腔内注射、心肌内定（多）点注射、心包内注射（介于心肌与心包膜之间），其中静脉注射包括尾静脉注射、颈静脉注射、面部静脉注射等。最常用的方法是心肌定点注射和尾静脉注射。

注意事项：

1）心腔内注射需要结合主动脉嵌夹进行，由于开胸腔手术需要辅助呼吸，对手术操作要求较高。注射体积约为 20μL 左右。

2）心肌内定点注射时，使用 27 - 29 G 的针头，每点注射约 2 - 5μL，注意缓慢注射，病毒在注射的局部点附近感染较好，扩散有限。并且心脏定点注射需要开胸并辅助呼吸，对手术操作要求较高，也需要花费更长的操作时间。

3）由于心脏血流快，或者由于病毒进入血液系统以后，肝脏的首过效应，使尾静脉注射的病毒不容易富集在心脏（反而在肝脏的富集程度更高），因此相比其他器官，尾静脉注射需要更高的病毒量。

三、血清型选择

左心室前壁单次注射心肌肌钙蛋白 T 启动表达 Luc 的 5 种血清型 AAV 载体。活体成像及荧光素酶活性测定实验显示 AAV9 组心脏荧光素酶活性最高。表明AAV9是目前最有效的用于直接注射转导成年小鼠心脏的血清型。

参考文献：Prasad KM, Smith RS, Xu Y, French BA. J Gene Med. 2011.

活体成像显示CMV 广泛表达，荧光素酶活性测定实验进一步表示心肌肌钙蛋白 T 启动基因在心脏特异表达。

图 2. 测试心脏基因传递的特异启动子

颈静脉注射心肌肌钙蛋白 T 启动表达 Luc 的 5 种血清型 AAV 载体，活体成像及荧光素酶活性测定实验显示AAV9组心脏荧光素酶活性最高。

图 3.5 种 AAV 血清型心肌细胞特异性基因传递

颈静脉注射心肌肌钙蛋白 T 启动表达 eGFP 的 5 种血清型 AAV 载体，4 周后心脏冰冻切片荧光检测显示AAV9 1×1011vg 病毒量时 eGFP 在心肌细胞表达最强。

参考文献：Prasad KM, Xu Y, Yang Z, et al. Gene Ther. 2011.

四、应用

rAAV 在心脏疾病如心力衰竭、心肌梗死治疗中的应用

在医学领域，心力衰竭是一种难治疗的高发病率和高死亡率的疾病，而通过基因治疗来加强心肌收缩力，给晚期心力衰竭病人带来了希望。rAAV 介导的肌浆网钙 ATP 酶 2a（SERCA2a）基因疗法在临床上已经取得了较好的效果，Lyon AR 等在大鼠构建心肌梗死（MI）后慢性心力衰竭（HF）模型，至少梗死 16 周后大鼠尾静脉注射总量为 2×1011drp（DRP：DNase resistant particles 的缩写。表示能抵抗 DNase1 消化的病毒颗粒数）的 300μL AAV9.SERCA2a，注射后 4～6 周取材。慢性梗死大鼠心脏心室中段 10μm 切片 H&E 染色显示梗死面积大。Western blot 检测结果显示经 AAV9.SERCA2a 感染的 HF 大鼠，能够恢复心肌 SERCA2a 和肌集钙蛋白（CSQ）表达水平。对左心室 Emax（左心室 17 节段最大位移）、能量效率、舒张末期 P（压力）V（容积）关系（EDPVR）和左心室舒张末期压力（LVEDP）进行测量发现，HF 大鼠通过 SERCA2a 基因传递能提高 Emax，降低 EDPVR、LVEDP，改善心肌能量学，表明 SERCA2a 基因传递至衰竭心肌细胞可降低基底 Ca2 +水平，并以能量有利的方式启动反向重塑，从而改善左心室功能，达到治疗心力衰竭的效果。

参考文献：Lyon AR, Bannister ML, Collins T, et al. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011.

C57BL/ 6J 未损伤小鼠尾静脉注射 100μL 生理盐水溶解的 3.0×1011GC rAAV9 -CMV-Wnt11，2 周后 Western blot 检测 Wnt11 蛋白表达。结果显示 AAV9 可以介导 Wnt11 实现心脏高水平蛋白表达。

手术诱导 MI 前的 1 周，接受 GFP 表达小鼠骨髓移植的野生型（WT）小鼠尾静脉注射 3.0×1011GC 编码 Wnt11（rAAV9 -CMV-Wnt11）或 LacZ（rAAV9 -CMV-LacZ）的 rAAV9 载体，MI 8 周后监测存活率。通过结扎 LAD（左前降支）冠状动脉的近端部位诱发心肌梗死，从而诱发更大的梗死，通常导致相对较高的死亡率。然而，所有注射 rAAV9 -Wnt11 的小鼠存活到第 8 周处死时，同一时间段内 40% 以上 rAAV9 -LacZ 处理的小鼠死亡。尸检发现死亡小鼠有胸腔积液的证据，表明死亡原因是心力衰竭。

为了确定 rAAV9 -Wnt11 治疗是否能增强缺血性损伤后的心功能，损伤前超声心动图评估左室射血分数（LVEF）、左心室舒张末期容积（LVEDV）、每搏输出量（SV），并于心肌梗死后存活小鼠第 1 天和第 2、4、8 周重复评估。在所有每周时间点，注射 rAAV9 -Wnt11 的小鼠 LVEF、SV 显著高于注射 rAAV9 -LacZ 的小鼠，这些显著差异不能归因于 rAAV9 -LacZ 处理组的死亡率，因为存活的 rAAV9 -LacZ 处理小鼠在第 2 周和第 4 周的 LVEF 和 SV 均值高于随后死亡小鼠。另一方面，Wnt11 的表达并没有显著改变 LVEDV 和左心室收缩末期容积（LVESV）。

Wnt11 基因表达对梗死面积的潜在影响通过存活至第 8 周的小鼠心脏切片天狼星红染色测量纤维化程度来评估。rAAV9 -Wnt11 治疗小鼠明显比 rAAV9 -LacZ 处理小鼠纤维化范围小，但是两组之间差异没有达到统计学意义。然而，在非梗死区域 rAAV9 -Wnt11 治疗后纤维化和血管周围纤维化明显低于 rAAV9 -LacZ 处理后。因此，相当一部分与心肌恢复期间 Wnt11 基因表达相关的益处可归因于心脏非梗死区的改善。

图 7. 心肌梗死（MI）恢复期间 Wnt11 表达可改善存活率、心功能和减少心脏非梗死区的纤维化

参考文献：Morishita Y, Kobayashi K, Klyachko E, et al. Sci Rep. 2016.