编者按

腺相关病毒（AAV）载体是治疗多种人类疾病的主要基因传递平台。重组腺相关病毒（rAAV）是基因治疗赛道中最有潜力的基因递送载体。临床需要的AAV衣壳的开发、基因组设计的优化和革命性生物技术的利用三方面的研究进展为基因治疗领域的发展做出了重大贡献。2012年，基于AAV的基因治疗产品Glybera被欧洲药品管理局（EMA）批准用于治疗脂蛋白脂肪酶缺乏症，成为第一个批准上市的基因治疗药物。2017年，基于AAV的另一款治疗遗传性视力障碍（2型先天性黑蒙症LCA）的基因药物Luxturna被美国食品药品监督管理局（FDA）批准上市。2019年，诺华旗下治疗脊髓性肌肉萎缩症（SMA）的AAV基因治疗药物Zolgensma也被FDA批准上市。AAV介导的基因置换、基因沉默和基因编辑的临床前和临床成功案例促使了AAV成为越来越受欢迎的理想治疗载体。尽管AAV在基因治疗领域取得令人鼓舞的成绩，但该方案仍具有一定的挑战，例如AAV工程化设计和病毒免疫反应，这需要对AAV的工作原理有更深层次的理解。深入研究AAV生物学，加强对相关疗法挑战和局限的理解将构建未来临床成功的基础。小编在这里给大家推荐国际基因治疗领域著名专家、美国基因与细胞学会当选主席、Voyager Therapeutics的创始人之一的高光坪教授作为通讯作者发表在Nature Reviews Drug Discovery（2019年IF=64.797）的综述文章“Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery”，本综述介绍了AAV的基本特性和病毒载体设计的一般原则，并对AAV的相关临床进展、AAV基因治疗策略及面临的挑战等进行总结。

一、AAV的基本特性

1. AAV的组成

AAV由一个正二十面体蛋白衣壳和一个单链DNA基因组构成。其蛋白衣壳由VP1、VP2和VP3三种亚基组成。单链DNA基因组两侧有两个反向末端重复序列（ITR），是病毒复制的起点，DNA基因组中的rep基因编码病毒复制所需的四种蛋白质，而cap基因则编码病毒的三个衣壳亚基。AAV基因组可以整合到人类细胞中称为AAVS1的基因组位点，以建立潜伏期。而由于rAAV缺乏rep基因，rAAV基因组整合大大减少。

2. AAV感染宿主细胞的过程
目前研究发现AAV的基因递送效力与宿主因素相关，AAV的有效性很大程度上取决于蛋白衣壳和靶细胞表面受体之间的分子相互作用。在病毒入侵宿主细胞后，AAV通过核孔复合体进入细胞核，并将基因组从衣壳中释放出来。目前使用的AAV有两类：单链AAV(ssAAV)和自互补AAV(scAAV)。

二、病毒载体的设计原则

1. AAV衣壳的设计

自AAV运用于临床以来，设计出新功能的AAV衣壳一直是病毒学家不断追求的目标。随着技术的进步，开发新衣壳的策略也在不断进化。目前衣壳的开发方法可分为四大类：自然发现、合理设计、定向进化和计算机生物信息学设计。这些方法各有利弊，例如自然来源的AAV虽然免疫原性低，但病毒的转导效率也是比较低的。

因此改进载体衣壳的首要方法，是通过合理设计进行工程化改造。而基于对AAV在细胞表面结合、内吞、转运、基因释放等过程的深入认知，定向进化策略也应运而生，该策略的基础是对自然进化的模拟，即衣壳在特定条件下产生具有特定生物学特性（如组织特异性靶向、免疫逃避和转基因表达）的遗传变体。基于Cre重组的AAV靶向进化（CREATE）技术是一种非常有潜力的的定向进化方案，目前定向进化结合大规模测序已经成为发现新载体衣壳的有效方案。

2. AAV基因组的设计

典型的AAV基因组带有一个基因表达盒，包括启动子、目的基因和转录终止信号。一旦载体进入到细胞核，这些成分共同作用可将目的基因的特定部位表达出来。基因表达盒的设计过程中，以下三点必须要注意。

2.1选择基因表达的方式

AAV通常会使用广谱高效表达的启动子来促进目的基因的高表达，例如巨细胞病毒（CMV）启动子。其他因素也会影响基因的表达，如GC含量、剪接位点、转录终止信号、核酸二级结构等。若要将基因特异性表达，还需要选择组织或细胞类型特异性启动子。

2.2控制基因表达的容量

与其他病毒载体相比，AAV载体的包装容量很小，大约只有5.0kb，因此基因表达的容量是需要考虑的因素，但目前已有若干种策略通过扩充AAV病毒包装容量以实现大片段治疗性基因的递送，其中最简单的方案就是设计目的基因的缩短版本，在不影响其功能的情况下减少基因表达的片段。

2.3增强基因表达的持久性

AAV是基因治疗的有效载体，但其装载的基因片段在有丝分裂细胞中逐渐丢失，因此科学家一直在寻找能够使目的基因持续表达的策略，其中最简单的方法是通过基因编辑技术促进AAV基因组整合。

三、AAV用于基因治疗的临床试验进展

截至2018年11月13日，已有145项基于AAV的干预性临床试验在ClinicalTrials.gov注册。到目前为止，有两种载体化的AAV血清型已获得监管部门批准用于患者的临床治疗：AAV1(Glybera；uniQure)和AAV2(Luxturna；Spark Therapeutics)。目前在临床试验中用作载体的衣壳血清型不到12种，其中最多的是基于AAV2设计的病毒载体。然而，更多、更新、更有效的病毒衣壳，如AAV8、AAV9和AAVrh.10，越来越多的进入到临床试验。

四、AAV的基因治疗策略

1. 基因置换

这一策略主要是将缺陷基因置换为功能完整的基因，该方案适用于治疗隐性单基因疾病。如基于AAV1载体的Glybera和基于AAV2载体的Luxturna分别在肌肉和眼睛局部使用以治疗脂蛋白脂肪酶缺陷和由RPE65双等位基因突变引起的视网膜营养不良。

2. 基因沉默

基因沉默适用于基因突变导致蛋白毒性增加引起的单基因疾病，如亨廷顿病。现在最常用的基因沉默手段是RNAi策略，其可有效抑制基因表达，但这一策略通常存在脱靶效应。

3. 基因添加

该方案是通过基因添加来治疗复杂的遗传病和获得性疾病。基因添加可以通过多种方式调节诸如心力衰竭和传染性疾病等需迫切解决的人类疾病。

4. 基因编辑

该方案是通过基因编辑技术直接修复致病基因的相关突变。治疗性基因编辑通常分为两个步骤：在基因组中产生靶向的DNA断裂和DNA修复，最终导致DNA发生改变。目前开发的Cas蛋白是一个强大的基因编辑系统，因操作性强而被广泛应用。

五、AAV基因治疗主要挑战

1. 工业化生产的成本

AAV基因治疗的最突出的问题是治疗费用高昂。2012年批准的Glybera每名患者需支付约120万美元。2017年批准的Luxturna每只眼睛费用高达42.5万美元。同样，2019年批准的Zolgensma每名患者需支付212.5万美元。其中最主要的原因是AAV工业化生产的成本高。

2. AAV基因治疗引起的免疫反应

AAV蛋白衣壳、DNA基因组和基因编码产物均能在宿主体内产生免疫反应，这极大的阻碍了目的基因递送和持续性表达。宿主体内会产生针对AAV衣壳的中和抗体（NAbs）。注射AAV后，病毒衣壳会触发强大的体液免疫反应产生大量的NAbs，进而阻碍AAV再次注射的有效性。此外，AAV衣壳和载体基因组在注射后通过Toll样受体2（TLR2）和TLR9被免疫系统感知，导致促炎细胞因子的产生并进一步促进适应性免疫反应。

六、展望

目前治疗基因通过病毒递送、基因编辑、纳米粒子和其他基因递送平台递送的相关研究均取得了实质性的进展。其中使用AAV载体的基因治疗临床试验呈指数级增长，说明基于AAV的基因治疗研究刚起步就进入了发展快车道。但要将AAV成功应用于临床基因治疗则需要多学科的联合应用。另外随着人类基因组计划的加速推进，全基因组学和基因治疗相辅相成，将遗传改变与疾病紧密联系了起来，这也预示着充分挖掘AAV基因治疗的潜力将有助于利用遗传密码进行临床创新药物的开发和转化。

AAV载体的基因疗法药物成本高，产能小。患者及医保负担重，受益病患数量有限。劲帆医药拥有自主研发的昆虫杆状病毒One-Bac 4.0系统专利群。0ne-Bac 4.0系统通过引入AAV蛋白表达控制新原理，结合关键工艺优化，在利用昆虫系统大规模量产AAV过程中，实现高产率、高活性、高实心率，单批次产能可达1E+18vg！该系统能真正满足神经、血液、代谢、肌肉等系统性基因治疗AAV药物患者急迫的用药需求，并降低患者和社会的用药负担。了解更多详情请添加客服微信：Genevoyager2022。

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