【新品放送】胚胎干细胞和诱导多能干细胞的饲养层细胞——小鼠胚胎成纤维细胞—

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【新品放送】胚胎干细胞和诱导多能干细胞的饲养层细胞——小鼠胚胎成纤维细胞

2023-03-23 阅读量：408

一、应用

胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs，简称ES细胞）在体外极易分化，必须在培养基中加入分化抑制因子或将其培养在能分泌分化抑制因子的饲养层细胞上才能维持培养。因此，对于有饲养层的多能干细胞扩增培养，选用状况良好的饲养层细胞至关重要。小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）是适用于小鼠或人胚胎干细胞（ESCs）及诱导多能干细胞（iPSCs）的饲养层细胞。MEFs能产生抑制ES细胞自主分化和促进ES细胞增殖的因子，能够有效促进ES细胞的增殖并维持其未分化特性和多能性，且分泌效果优于外源添加的一些因子，可以为ES细胞的培养提供类似于体内的微环境，故在研究哺乳动物ES细胞中得到广泛使用。

二、详情

三、运输

1）1 mL冻存细胞悬液装于1.8 mL的冻存管中，置于装满干冰的泡沫保温盒中进行运输。

2）T25培养瓶充满完全培养基后进行常温运输。

四、细胞接收后的处理

1）收到细胞后，请检查T25瓶是否有损坏、漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生，请拍照并及时和我们联系。

2）收到细胞先不开瓶盖，瓶身擦拭酒精、去掉封口膜并将T25瓶置于37 ℃培养2-4小时（视细胞密度而定）稳定细胞状态。接着在倒置显微镜下观察细胞生长情况，若大部分细胞漂浮，置于培养箱隔夜观察，大部分漂浮细胞重新贴壁，表明细胞活力正常，继续培养，剩余漂浮的细胞可以去掉；若大部分细胞仍然不贴壁，将漂浮的细胞离心收集，用台盼蓝染色鉴定细胞活力，并与本公司销售人员及时联系。

3）弃去T25瓶中的培养基，添加6 mL新的完全培养基。

4）如果细胞长满（90%以上）请及时进行细胞传代。

5）接到细胞次日，请检查细胞是否污染，若发现污染或疑似污染，请及时与我们取得联系。

6）建议客户收到细胞后前3天不同倍镜各拍几张细胞照片，记录细胞状态，如细胞出现问题请于一周内与本公司销售联系，以便于更好的帮您解决问题。

7）收到细胞后，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损及细胞有污染，请立即与我们联系。

8）收到细胞后请立即将冻存管转入液氮或者-80 ℃冰箱冻存或直接复苏，如无法立刻进行复苏操作，冻存细胞可在-80 ℃的条件下保存1个月。

五、细胞培养具体操作步骤

复苏：

将MEFs P0细胞冻存管从液氮中取出，置于37 ℃水浴中使之迅速融解，取出后拿到超净台内用75%酒精擦拭冻存管旋口处及外壁，防止污染。
将冻存管内细胞悬液转移至含3-4 mL MEFs完全培养液的15 mL离心管内，以1000 rpm，离心5 min。
离心后将上清液吸除，另加入新鲜的MEFs完全培养液2 mL，吹打悬浮。
轻轻吹打，制成单细胞悬液，尽量避免气泡。
按照MEFs细胞说明书上建议的复苏培养体系转移至1个T75培养瓶中培养，加入培养液14 mL。
放入37 ℃培养箱内培养。
复苏第二天观察，如死细胞较多，更换新鲜的MEFs完全培养液，可以使细胞生长的更好。

传代（T75细胞培养瓶）：

待细胞长到90%-100%满时进行传代，一般3-4天，具体视细胞生长情况而定。
吸除废液。
用PBS（不含钙镁离子）轻轻冲洗一遍。
加入2.5 mL的0.25%胰酶（含EDTA）至培养瓶，轻轻晃动，使胰酶覆盖底面，置于37 ℃培养箱内消化细胞。
在显微镜下观察，直至细胞层全部脱落（一般需要1-2 min）。
加2.5 mL MEFs完全培养液终止消化。
多次轻轻吹打细胞，制成单细胞悬液。
按照1:2的比例进行传代。放入37 ℃培养箱内培养。

冻存：

按传代的方法将细胞消化下来，制成细胞悬液。
以1000 rpm，离心5 min，弃上清，逐滴加入已经预冷的冻存液，悬浮细胞。
按每支冻存管内加入500 μL细胞悬液分装到冻存管内，标记细胞名称、代数、冻存日期等基本信息。
将冻存管置于程序降温盒内，-80 ℃过夜，转入液氮。

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