编者按

神经科学的一个核心目标是了解神经系统是如何在细胞和环路水平上进行信息的编码和处理。而神经元活性的基因编码指示剂的发展，极大的促进了这一目标的实现。在动物模型中，使用基因编码的钙指示剂检测神经元活动已经成为一种标准的研究方法。然而，大量不同类型的基因编码指示剂可能会让领域研究的新手很难选择适合他们研究的指示剂。小编在这里给大家推荐Lin MZ和Schnitzer MJ发表在《Nature neuroscience》题为“Genetically encoded indicators of neuronal activity”的综述文章，本文作者在一个标准范式中讨论多种类型的基因编码指示剂，并阐述其机制和适用环境，这些论述将有助于研究人员评估指示剂运用，并设计相关的实验。

一、基因编码指示剂的优势

基于光学成像的基因编码指示剂的广泛运用，源于该方案自身的极大优势。编码的报告基因能够对各种神经元活性事件做出及时的反应。而光学报告元件可被构建用于检测囊泡释放、神经递质浓度的变化、跨膜电压和细胞内钙动力学的变化。这些信息的捕获是电极记录和功能磁共振成像不能采集到的。

基因编码的指示剂还可以对特定神经元亚群信息进行采样，神经元亚型包括遗传学定义的神经元亚型、稀疏标记的细胞亚群和有特定解剖连接模式的细胞类型。此外基因编码的指示剂可稳定表达，以研究在学习记忆、生活事件、大脑发育或疾病进展中，神经元活性如何随着时间的变化而改变。

采用光学成像的方式，可以在活体动物中同时观察数以千计的神经元，并对整体神经活动进行特定的分析。光学成像的偏差会比电极记录小，因为一些神经元类型由于细胞形态、微弱的电偶极子或细胞外组织等问题对抗细胞外的电记录。光学成像还有一个电极记录无法比拟的优势，就是可将神经元损伤降至最低。在某些模式生物中（斑马鱼），光学成像甚至可以无损地进行成像和长期成像。

二、使用基因编码指示剂时的注意事项

在使用光学成像的基因编码指示剂前需要解决某些技术问题，以便能通过具体的指标以及适当的设置，来获得预期的成像质量。

首先，长期表达的遗传指示剂是通过病毒感染或转基因动物进行表达，而这两者都需要经验优化。病毒有许多类别和血清型，必须在目标的细胞中测试病毒的转导效率和细胞毒性。转基因动物身上可能由于表达的指示剂水平不够高，无法达到预期的效果，或者由于脱靶效应在非目标的细胞类型中表达。

其次，即便在理想条件下，光学成像也受到光子发射和探测的量子力学随机性的限制。这些因素限制了检测神经元活性事件的保真度和准确性。为了表征单个动作电位检测的保真度，可采用信号检测理论的度量d/，d/的计算考虑了实际情况下影响事件检测的几个因素，包括指示器亮度、响应幅度和动力学，以及背景荧光和波动。因此，d/比分数荧光变化(∆F/F)或信噪比之类的旧指标更好地预测尖峰检测保真度。

最后，遗传编码指示剂的一个重要考虑因素是记录的信号受指示剂的响应特性的影响。指示剂的关键属性包括荧光响应曲线和响应动力学。由于遗传编码的指示剂测量事件的时间跨度可以从毫秒到分钟，因此需要选择具有足够的响应性和响应速度的指示剂。此外，实验是否需要敏感事件的检测(例如，动作电位)、精确的事件计时(例如，解决神经同步放电的问题)、准确的时间波形报告(例如，膜电压或细胞内钙的波动)等。

三、基因编码指示剂的类型

本部分的重点将放在主要指示剂类型的比较上。对于每一类指示剂将讨论其工作的机制，比较特定指示剂的性能特征，并将其与实际应用相联系。分类将遵循突触传递兴奋的生理顺序：囊泡融合、神经递质释放、电压变化和钙内流。

1.泡囊释放指示剂

突触囊泡释放是神经元间信号传递的基本步骤，受神经元活动和调节过程的影响。囊泡释放的可视化可提供一种不依赖于突触后的状况，跟踪特定神经元输出活动的方法。

检测突触囊泡释放可以使用囊泡定位的遗传编码pH指示剂（GEPI）来检测。囊腔的pH值通常为5.5，而细胞外环境的pH值为7.0-7.5。因此，膜融合后，突触囊泡的内容物经历了pH从5.5到7.5的变化。GEPI是一种荧光蛋白，在特定波长显示出依赖于pH的亮度。在野生型GFP发色团中，酚氧存在于质子化和去质子化状态之间的pH依赖平衡中，分别在400 nm和488 nm附近有最大吸收。而488 nm的GEPI-pHluorin，在pH 5.5时荧光很暗，而在较高pH值时荧光变亮。SEP与囊泡跨膜蛋白VAMP、突触素或VGLUT的腔侧融合也被用于指示囊泡融合。

图1.遗传编码的pH指示剂

表1.遗传编码pH指示剂的选择

2.神经递质指示剂

GEPI在检测囊泡释放过程中，并不能针对囊泡的神经递质内容物。神经系统中存在几十种神经递质和神经调质，它们对突触后神经元活动均有重要的影响。因此，对特定神经递质的释放进行成像是解剖神经环路的重要一步。

囊泡融合后，神经递质立即释放到突触间隙中。此时递质发生了从高微摩尔到低毫摩尔的浓度范围的变化，然后被快速动力学响应的神经递质转运蛋白移除。神经递质的高浓度和快速动力学移除的特点，使得开发递质释放指示剂成为可能。此外，不同于囊泡胞吐、电压或钙指示剂，神经递质并不存在小分子荧光指示剂。

基因编码的递质指示剂（GETI）可以在突触前或突触后细胞膜上表达，从而可视化特定突触前或特定突触后细胞类型的神经传递。第一个中枢神经系统可视化的GETI，是指示兴奋性神经递质谷氨酸的FLIPE，它由融合到细菌谷氨酸转运体Glt1的谷氨酸结合区的CFP和YFP组成。而具有优化接头的指示剂-超级谷氨酸感应荧光指示剂(SuperGluSnFR)是新一代的GETI。在培养的海马神经元上表达SuperGluSnFR，可以检测到高达44%的比例变化的谷氨酸。

研究者们使用循环排列的GFP(cpGFP)和Glt1设计出响应性更高的iGluSnFR。当在488nm激发光情况下，iGluSnFR在与谷氨酸结合时变亮。iGluSnFR对突触活性的敏感性的检测超过了GEPI。iGluSnFR响应单个动作电位过程中，指示剂的基线亮度比SEP亮得多，因此iGluSnFR在检测突触释放方面比SEP更敏感。

图2.遗传编码的神经递质指示剂

表2.遗传编码的神经递质指示剂的选择

3.跨膜电压指示剂

虽然GETI检测了神经递质的释放，但神经递质的主要作用还是改变了突触后膜的膜电位。要检测后续的神经活动的变化，需要跨膜电压指示剂。跨膜电压指示剂也是单个神经元内毫秒级响应检测的主要手段。

化学电压敏感染料通常具有快速动力学特征，但它们通常具有较高的光毒性，既不能通过基因靶向表达，也不能对单细胞进行长期成像研究，并且无法获得活体哺乳动物大脑中的单个神经元放电信号。1997年，第一个遗传编码电压指示器（GEVI）Flash被开发出来，Flash包含插入到Shaker钾通道中的单个GFP结构域。然而，Flash并不能在哺乳动物细胞的细胞膜上表达。2007年，从VSFP2家族开始，利用电压敏感磷酸酶的VSD（电压敏感结构域），在哺乳动物神经元中发挥良好功能的GEVIs最终被开发出来。目前的GEVI包括蝴蝶家族、VSFP3家族、ElectricPk、ArcLight家族、动作电位加速传感器（ASAP）家族等。一般情况下，去极化后VSD的移动会导致融合的荧光蛋白变暗。

Opsins（视蛋白）是另一类电压敏感蛋白结构域。视蛋白家族泵或通道的非传导性突变体在电压敏感的质子化-去质子化平衡中含有视网膜的希夫碱作为生色团。去极化将平衡从去质子化转变为质子化，主吸收峰从蓝色（400 nm）向橙色（600 nm）波长转变，因此在橙色光激发时荧光增加。

图3.遗传编码的跨膜电压指示剂

表3.遗传编码跨膜电压指示剂的选择

4.钙指示剂

钙成像是目前最成熟的检测神经元活性的成像方式，可对神经元的整体动力学、树突和突触功能进行快速或长期研究。钙离子是神经递质接收和膜去极化的第二信使。静息状态下，胞浆钙维持在50-100 nM，而神经元可通过多种途径诱导钙离子内流。第一个基因编码的钙离子指示剂（GECI）Cameleon，由钙调蛋白（CaM）、ECFP和EYFP之间的M13结构域组成，通过FRET（荧光共振能量转移）增加报告钙信号。

与基于FRET的GECI相比，单色荧光基团的GECI在捕获钙信号上有更大的响应。传感器G-CaMP（后来缩写为GCaMP）将CaM融合到cpGFP145的C端，将CaM结合肽融合到N端。在GCaMP的CaM结构域中，His148与去质子化的发色团氢键结合从而稳定发色团。目前最常用的GECI是GCaMP6系列。GCaMP6m、GCaMP6s和GCaMP7对单个AP（动作电位）产生更大的响应，但相应的其衰减时间比GCaMP6f长。

目前基因编码的钙离子指示剂（GECI）成像的主要局限性是不能准确地判断递质受体的激活或动作电位放电，也不能很好地报告膜超极化或阈下电压变化。

图4.遗传编码的钙指示剂

表4.遗传编码的钙指示剂的选择

四、结论

基因编码的钙指示剂已经彻底改变了系统神经科学，允许研究神经元亚群和整个大脑、神经活动随时间的变化、以及对突触激活的亚细胞反应的神经编码。目前囊泡融合、神经递质和跨膜电压的基因编码指示剂正在快速发展，未来基因编码的细胞活动指示剂将变得更加多样，同时也成为理解大脑特定回路功能的核心部分。光学方法的一个强大方面是，它们可以很容易地组合在一起，以便在实验的不同阶段通过多种方法研究相同的细胞。例如，将神经元活动可视化、光遗传学操作、和对同一细胞形态学、连通性和大分子分布的解剖后观察的结合变得越来越可行。在未来，结合光学方法的研究可能会变得很常见，基因编码的活动指示剂可以作为观察体内神经元活动的初始步骤。

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