一、研究背景与领域痛点

脑内皮细胞（brainECs）是血脑屏障（BBB）的核心结构，精确调控脑实质的物质交换与微环境稳态。其功能异常可直接导致脑海绵状血管畸形（CCM）、脑动静脉畸形（bAVM）等严重脑血管疾病——其中CCM影响全球约0.2%人口，bAVM则以高出血风险、高致死致残率成为神经外科的难治性疾病。

针对brainECs的基因操作是研究上述疾病发病机制、开发治疗手段的核心基础，但领域内长期面临工具层面的多重瓶颈：

1）近年通过衣壳改造技术已开发出AAV2-BR1、AAV-PHP.V1、AAV-BI30、AAV-X1等多种AAV突变体，可在成年啮齿类动物中实现brainECs的基因递送与标记。但在发育早期静脉给药、发育期/成年期颅内局部注射这两类关键实验场景下，上述载体均无法同时实现高转导效率与高内皮特异性，普遍存在神经元、胶质细胞等非靶细胞的异位表达，难以支撑局灶性疾病模拟、脑血管发育机制等核心研究方向。

2）搭载CAG、CMV、Ef1α等通用强启动子的衣壳改造型rAAV，无法实现严格的细胞类型特异性表达；而基于顺式调控元件的特异性启动子方案，受AAV载体＜4.7 kb的包装容量上限限制，现有已报道的内皮特异性微型启动子（如基于Cldn5的Ple261，全长2963 bp）仍占用大量载体空间，留给外源致病基因、基因编辑元件的装载余量不足，直接限制了疾病建模与基因治疗的应用范围。

3）通过传统基因编辑技术构建的脑血管畸形小鼠模型（如KRAS、CCM1/2/3突变模型）实验周期长、构建效率低，且难以模拟临床患者散发性、局灶性的体细胞突变发病特征，缺乏快速、灵活、可精准复刻临床病理特征的疾病建模工具。

基于上述背景，北京脑科学与类脑研究所戈鹉平研究员与孙文智研究员团队联合攻关，从内皮细胞特异性基因Tek的内源转录调控序列入手，开发rAAV-miniBEND（rAAV-based mini-system for brain endothelial cells）脑内皮靶向递送系统，从转录调控层面实现brainECs的高特异性基因表达，同时大幅压缩调控元件长度以释放载体装载空间，较好地补充了现有AAV工具的场景局限。

二、核心技术设计：基于Tek内源调控元件的理性工程化

与传统衣壳改造的靶向策略不同，miniBEND系统从基因表达调控的源头实现细胞类型特异性，核心是对内皮标志基因Tek的调控序列进行截短优化与功能验证。

1.元件筛选与特异性机制

研究团队跨物种比对了人、猴、大小鼠、猪、牛等物种的Tek基因序列，筛选出转录起始位点上游及第一内含子区的高度保守序列，通过系统截短实验与体内功能验证，最终确定最优组合：mPro723最小启动子+mCis700顺式作用元件。

特异性核心逻辑：单独的Tek启动子会在神经元、星形胶质细胞中广泛启动转录，不具备内皮表达限制性；搭配源自Tek第一内含子区的mCis700顺式元件后可实现细胞特异性调控。该元件携带CACA、GATA、Ets-1多重转录抑制基序，能在神经元、血管壁细胞（周细胞+血管平滑肌细胞）中阻断转录起始，最终让外源基因表达严格局限于brainECs。

小脑非特异表达优化：通过逐步截短启动子5'端序列，最终的mPro723版本几乎完全消除了小脑浦肯野细胞的异位表达，全脑范围内神经元、胶质细胞的非特异性表达几乎检测不到，解决了此前多数内皮启动子在小脑区域易出现神经元脱靶的共性问题。

2.表达强度优化与装载容量优势

天然Tek迷你启动子的表达强度偏弱，研究团队通过引入CMV-珠蛋白嵌合内含子（glo566/glo228）显著增强了转录起始活性。最终的优化版本mPro723+glo228组合总长951 bp，miniBEND-S（mPro723+glo228+mCis700整套调控盒）仅占用～1.9 kb，在AAV＜4.7 kb包装上限下，最多可为外源目的基因留出约2.8 kb的插入空间，为装载大片段致病基因、碱基编辑器、CRISPR系统等创造了条件。

3.衣壳兼容性

该系统的特异性不依赖特定AAV血清型，可灵活搭配PHP.eB、BI30、9P13等不同衣壳，适配透过BBB全身递送、局部精准注射等多样化研究场景。

图1.靶向brainECs特异性标记的rAAV-miniBEND系统构建与元件筛选

图2.优化嵌合内含子提升rAAV-miniBEND系统的脑内皮表达强度

三、系统性能验证：多维度特异性与效率评估

 作为工具开发类研究，文章通过不同注射途径，系统验证了miniBEND在各场景下的特异性、转导效率与适用范围。

1.全身静脉给药：高效标记与低外周脱靶

细胞水平共定位：对出生后5-10 d的Ai14报告小鼠静脉注射AAV-PHP.eB-miniBEND-Cre（mPro723-mCis700），脑组织切片免疫荧光统计显示tdTomato阳性细胞中CD31阳性内皮细胞占比接近100%，流式细胞术检测该比例约95%。周细胞、平滑肌细胞、神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞，均未检测到共定位。

标记效率：成年小鼠高滴度静脉注射AAV-PHP.eB-miniBEND-S（mPro723-glo228-mCis700）-EGFP，皮层、海马等主要脑区brainECs的标记效率可达90%~95%，仅小脑区域效率略低。

外周脱靶水平：肝脏、肾脏、心脏、肠道等外周器官几乎检测不到转基因表达；仅肺部极少数大血管、脾脏和胃组织的少量小血管存在微弱信号，脱靶表达水平远低于通用启动子载体，提升了全身给药的安全性。

表达时长：野生型小鼠静脉注射AAV-PHP.eB-mPro723-glo566-EGFP-pA-mCis700后，脑内皮基因表达可稳定维持至少3个月，满足长期疾病建模与功能研究需求。

2.颅内局部注射：维持高内皮特异性

局部注射的高特异性是miniBEND突出的差异化优势，为局灶性内皮精准操控提供了新的解决方案。

既往衣壳改造载体在全身静脉注射时具备良好的脑内皮靶向性，但直接进行脑实质局部注射时，由于绕过了BBB的筛选作用，内皮特异性会明显下降：

局部成像对比：BR1/BI30局部注射可见大量神经元荧光信号，无法实现纯内皮标记，而搭配miniBEND调控元件的AAV-PHP.eB/9P13，即便局部注射，荧光信号几乎仅局限于血管内皮，仅存在极微量神经元泄漏。

miniBEND的特异性建立在转录调控层面，这一特性支撑了三类核心研究：

1）在特定脑区定点诱导病变，模拟临床散发性、局灶性脑血管病灶；

2）构建更贴合临床特征的局灶性疾病动物模型；

3）配合颅窗活体成像技术，长期追踪单个病灶的演化过程，不受全脑广泛病变的干扰。

3.发育阶段给药：维持高内皮特异性

针对胚胎、新生阶段的研究需求，系统分别验证了不同发育时期的给药效果：

新生鼠侧脑室注射（P0-4）：可维持脑内皮高特异性；相比之下，常规衣壳工具在该阶段的内皮标记效率相对有限，且非特异表达更为明显。

胚胎期宫内脑室注射（E15-18）：同样可实现高特异性的脑内皮标记，为先天性脑血管发育研究提供了工具支撑。

4.跨物种适配性

除小鼠外，将小鼠源miniBEND元件（mPro723-mCis700）直接应用于大鼠，同样实现了高效特异的脑内皮标记，证明该工具可直接跨物种使用。此外，研究团队在小鼠脑内系统比较了不同物种来源的调控序列组合，包括人源同源组合、人-狨猴/人-猪跨物种组合，以及大鼠同源组合。结果显示，上述组合均可驱动内皮特异性表达，提示该调控逻辑具有跨物种保守性；其中，与小鼠亲缘关系最近的大鼠同源组合活性最强，表明序列来源物种与宿主物种的亲缘关系越近，功能兼容性越好。实际应用中如需跨物种使用，建议根据目标物种优化同源序列。

图3.多给药途径下rAAV-miniBEND脑内皮基因递送性能表征

四、应用验证：脑血管畸形疾病模型构建

 工具开发的最终价值在于落地应用。研究团队利用miniBEND系统，通过不同注射策略成功构建了两种关键的脑血管畸形模型，并在bAVM模型中完成了药物筛选验证，实现了从“工具开发”到“应用验证”的完整闭环。

1.散发性脑海绵状血管畸形（CCM）模型

将临床致病突变MAP3K3^I441M克隆进入miniBEND载体，通过两种注射策略构建不同类型的CCM模型：

全脑弥漫型模型（眶后静脉注射）：静脉给药后可诱导小鼠全脑多发海绵状病灶，FITC-dextran渗漏实验证实BBB破坏，出现典型“爆米花样”出血与含铁血黄素沉积，MRI影像特征与临床IV级CCM高度吻合；

局灶型模型（颅内局部注射）：局部脑区给药可精准诱导局灶性CCM病灶，高度模拟临床散发性患者的病理特征；而常规衣壳载体在局部注射时会大量非特异侵染实质细胞，难以实现纯内皮驱动的局灶病灶构建。

图4.CCM疾病模型的病理与影像验证

2.脑动静脉畸形（bAVM）模型

通过颅内局部注射AAV-miniBEND-Cre至Braf-CA^fl/fl（Cre激活型Braf^V600E条件敲入）小鼠的皮层/海马，仅需2~3周即可形成典型局灶性bAVM病变：

病理表型：血管扩张、动静脉短路、BBB渗漏、内皮-间质转化（EndMT）；模型同时适配多模态成像研究，可通过颅窗活体成像、激光散斑血流成像、全脑组织透明化3D成像，实现从病灶动态演化到畸形血管网络三维结构的多维度观测。

功能表型：模型小鼠出现偏瘫、癫痫发作，3个月整体存活率低于50%，高度模拟临床疾病进程；

药物筛选验证：给予BRAF^V600E抑制剂PLX4032（维莫非尼，临床常规用于恶性黑色素瘤治疗）干预后，bAVM病灶直径、畸形血管密度均显著下降，证明该模型可用于靶点验证与药物筛选，也提示PLX4032有望跨适应症用于bAVM患者治疗。

图5.bAVM模型的动态演化与药物干预效果

3.其他功能验证

除疾病建模外，该系统还可支撑多种功能研究：

条件性基因敲除：局部注射Glut1^fl/fl小鼠，内皮细胞敲除效率平均达61.65±14.89%；全身给药Tak1^fl/fl小鼠，可诱导全脑范围的血管消退；

脑血管发育研究：发育阶段给药可用于研究胚胎期、新生期脑血管发育机制；

基因治疗候选载体：高特异性+低外周脱靶的特性，为脑血管疾病的基因治疗提供了更安全的载体选择。

五、总结与定位

rAAV-miniBEND是一项典型的“工具开发+应用验证”型研究。它并未否定现有衣壳改造工具的价值——BR1的开创性、BI30的全面性、X1.1的转化潜力，均已在各自的优势场景中得到充分验证。

该工作的核心价值，是从转录调控的技术路线出发，较好地补齐了现有衣壳工具在三类场景下的应用局限：颅内局部注射的特异性、发育阶段给药的适配性、大片段基因的装载容量。

它的出现为脑血管研究提供了新的工具选择：

1）针对局灶性脑血管畸形、散发性发病机制研究，它是目前已报道体系中，可在颅内局部注射下实现高特异性内皮操控的AAV工具；

2）针对需要装载大基因、CRISPR元件的研究，其紧凑的调控序列提供了显著的容量优势；

3）针对脑血管发育研究，它提供了胚胎/新生期高特异性的基因操作手段。

同时，依托该工具构建的bAVM模型不仅复刻了临床病理特征，还可直接用于药物筛选与靶点验证，初步提示了临床已上市药物跨适应症应用的可能性。

当然，该工具目前仍以啮齿类验证为主，非人灵长类的转导效率与特异性有待进一步验证；天然迷你启动子的表达强度弱于CAG等通用强启动子，更适合需要高特异性、中等表达强度的研究场景。

我司可提供rAAV-miniBEND载体，列表如下：