肥胖发生率上升正推动全球非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)流行。NAFLD包含两个阶段：以脂质过度蓄积为特征的单纯性脂肪肝(NAFLD早期)和标志疾病进展的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。脂质代谢失衡是NAFLD的主要病因。肝脏脂质调控涉及脂肪酸摄取、从头脂质生成(DNL)和脂质氧化等复杂过程。DNL是将碳水化合物转化为脂肪酸的严格调控过程，依赖胰岛素信号通路及关键转录因子如固醇调节元件结合蛋白1c(SREBP-1c)和肝X受体(LXRs)。SREBP-1c上调DNL通路中脂肪酸合酶(Fasn)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(Scd1)的基因表达。在肥胖等条件下，失控的DNL导致甘油三酯（TG）过度蓄积，因此调控肝脏脂质生成成为NAFLD治疗的潜在策略。

白细胞介素22(IL-22)是由固有淋巴细胞分泌的蛋白，具有组织修复功能，并通过防止肝细胞凋亡、调节脂质代谢和增强胰岛素敏感性来保护肝脏免受NAFLD侵害。这些作用涉及信号转导和转录激活因子3(STAT3)和蛋白激酶B(Akt)信号通路。IL-22通过与由IL-22受体α1亚基(IL22RA1)和IL-10受体β亚基组成的受体复合物结合而发挥信号作用。IL22RA1作为IL-22的功能性受体，特异性表达于肝脏、胰腺和肠道等代谢组织。此外，IL22RA1还与IL20R2结合形成IL-20和IL-24的受体。值得注意的是，仅IL-22能激活肝细胞中的STAT3，而IL-20和IL-24对代谢紊乱的影响微乎其微。由于IL-22/IL22RA1通路具有组织保护和代谢调节作用，且不影响免疫系统，靶向该通路为NAFLD治疗提供了新希望。然而，IL22RA1在肝细胞中的精确功能及其在NAFLD中的作用仍需进一步探索。

氧化甾醇是代谢调控的关键因子，具有治疗潜力。它们是由胆固醇通过特定反应产生的生物活性脂质，影响免疫、炎症过程和代谢综合征。胆固醇稳态破坏导致的氧化甾醇失衡会损害代谢稳态。如，17-羟孕酮(胆固醇转化为皮质醇过程中形成的类固醇中间体)的全身给药或肝脏蓄积会导致小鼠高血糖和胰岛素抵抗（IR）。相反，25-羟基胆固醇水平升高可减轻肝脂肪变性。尽管氧化甾醇在代谢疾病中至关重要，但内源性氧化甾醇与肝脏脂质代谢之间的具体联系尚未完全明确。

近期，上海交通大学医学院附属第六人民医院胡承研究员/陆炎研究员团队在肝病学领域顶刊Hepatology（IF=12.9）发表以“Hepatic IL22RA1 deficiency promotes hepatic steatosis by modulating oxysterol in the liver”为题的研究论文。作者发现，在棕榈酸（PA）处理的小鼠原代肝细胞(MPHs)、NAFLD模型小鼠及患者的肝脏组织中，IL22RA1表达均下调。肝细胞特异性Il22ra1基因敲除（HKO）小鼠在高脂饲料（HFD）和高果糖高胆固醇（HFHC）饲料喂养下，均表现出加重的肝脂肪变性。其机制为：肝细胞中IL22RA1缺失通过氧化甾醇——3β-羟基-5-胆甾烯酸（3βHCA）介导的脂质生成加剧肝脂肪变性，该过程涉及激活转录因子3（ATF3）/氧化甾醇7α-羟化酶（CYP7B1）信号轴。此外，HFD喂养条件下，HKO小鼠肝脏中恢复CYP7B1表达或沉默ATF3，均可降低肝脏3βHCA水平及脂质含量。这些研究结果揭示了3βHCA的促脂质生成作用，并彰显肝细胞IL22RA1在NAFLD进展中的调控作用。

1.IL-22过表达改善HFD诱导的肝脂肪变性

为评估腺相关病毒（AAV）介导的IL-22过表达对肝脂肪变性的影响，研究人员将7周龄C57BL/6J小鼠HFD喂养8周后，通过尾静脉注射AAV-IL-22或AAV-GFP。酶联免疫吸附试验（ELISA）验证了AAV-IL-22组小鼠血清IL-22水平显著升高。尽管两组小鼠体重无显著差异，但IL-22过表达组小鼠的肝重、肝重/体重比均下降，且肝脂肪变性程度减轻——表现为肝脏TG水平低于对照组。肝组织切片油红O染色和苏木精-伊红（H&E）染色进一步证实，AAV-IL-22组小鼠肝脏脂质蓄积减少。实时荧光定量PCR（qPCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot）结果显示，IL-22过表达显著下调生脂基因的表达[全长无活性SREBP-1c（FL-SREBP-1c）、其N端活性片段（N-SREBP-1c）及脂肪酸合酶（FASN）的蛋白表达水平均显著下降]；然而，两组小鼠脂肪酸氧化相关基因的表达无显著差异。此外，HFD喂养的AAV-IL-22组小鼠，其肝损伤标志物[血清丙氨酸转氨酶（ALT）、天门冬氨酸转氨酶（AST）]及血清TG水平均显著降低。IL-22过表达还与炎症和纤维化相关基因的表达下调相关。胰岛素耐量试验（ITT，腹腔注射胰岛素）显示，与对照组相比，AAV-IL-22组小鼠胰岛素敏感性显著增强，但两组小鼠的空腹血清胰岛素水平和糖耐量无显著差异。上述数据表明，IL-22可缓解HFD诱导的NAFLD进展。

类似地，在标准饲料（CD）喂养条件下，AAV-IL-22组小鼠的肝脏TG水平仍低于对照组。肝组织切片油红O染色和H&E染色证实了这一降低趋势。这些结果表明，在模拟生理状态的CD喂养条件下，IL-22同样可降低小鼠肝脏TG含量。

图1.IL-22过表达对HFD诱导的肝脂肪变性具有保护作用

图2.IL-22过表达同样可减少CD喂养小鼠的肝脏脂肪蓄积

2.脂肪肝组织及PA处理MPHs中IL22RA1表达降低

为探究IL22RA1的内源性作用，研究者检测了其在3种NAFLD小鼠模型中的表达。肝脏样本的Western blot分析显示，与正常对照组相比，HFD（16 w）小鼠、db/db小鼠（瘦素受体基因突变纯合子）和ob/ob小鼠（瘦素基因突变纯合子）的肝脏IL22RA1蛋白水平均显著下调。PA处理MPHs的实验结果显示，随着PA浓度升高，IL22RA1表达逐渐降低。此外，与健康个体相比，HFHC饲料（30 w）诱导的NASH小鼠及NAFLD患者的肝脏IL22RA1蛋白水平均降低。基于公共单核RNA测序（snRNA-seq）数据（GSE189600）分析显示，在人类肝脏样本中，与肝脏非实质细胞（NPC）相比，肝细胞中IL22RA1 mRNA表达显著富集；这一结果通过MPHs的qPCR分析得到验证。

图3.IL22RA1在脂肪肝组织及PA处理MPHs中表达下调

3.肝细胞特异性IL22RA1缺失加剧HFD诱导的肝脂肪变性及HFHC饲料诱导的NASH

为研究IL22RA1对肝脏脂质代谢的影响，作者对肝细胞特异性IL22RA1敲除（HKO）小鼠进行了分析。肝脏组织的qPCR、Western blot及免疫荧光染色结果证实，HKO小鼠肝脏中IL22RA1被成功敲除，且不影响其他组织的IL22RA1表达。HKO小鼠来源的原代肝细胞经IL-22刺激后，磷酸化STAT3（p-STAT3）水平未升高，表明IL22RA1敲除有效。

尽管CD喂养的HKO小鼠与同窝对照（flox/flox）小鼠的肝重、肝重/体重比、血清TG水平及体重无显著差异，但HKO小鼠肝脂肪变性程度呈加重趋势——表现为肝脏TG含量略高，脂质蓄积增加。此外，与对照组相比，HKO小鼠血清ALT和AST水平升高，糖耐量和胰岛素耐量略有受损，提示即使在CD喂养条件下，肝细胞IL22RA1缺失也会促进肝脏TG蓄积。

HFD喂养条件下，HKO小鼠的肝重、肝重/体重比及肝脏TG含量均显著高于flox/flox小鼠。油红O染色和H&E染色证实，HKO小鼠肝脏脂质蓄积显著增加。然而，两组小鼠的血清TG水平无显著差异。HKO小鼠肝脏中生脂基因表达显著上调，而脂肪酸β-氧化相关基因表达与对照组无显著差异，这与两组小鼠代谢率无明显变化的结果一致。与肝脂肪变性加重相对应，HKO小鼠血清ALT和AST水平显著升高，提示肝损伤加剧。此外，RNA-seq和qPCR结果显示，与对照组相比，HKO小鼠肝脏中炎症和纤维化相关基因表达显著上调。ITT和糖耐量试验（GTT，腹腔注射葡萄糖）结果显示，IL22RA1缺失加剧了IR和糖耐量异常。IR增强导致HKO小鼠空腹血清胰岛素水平高于对照组。综上，这些结果表明，肝细胞IL22RA1缺失会加剧HFD诱导的肝脂肪变性，并破坏血糖稳态。

研究人员进一步探究了肝细胞IL22RA1在HFHC饲料诱导的NASH中的作用。HFHC饲料喂养后，HKO小鼠与对照组体重无显著差异，但肝重、肝重/体重比略高。H&E染色、油红O染色及肝脏TG含量检测结果显示，HKO小鼠肝脂肪变性程度加重。天狼猩红（Sirius red）染色、Masson染色结果显示，HKO小鼠肝脏胶原沉积增加；同时，其肝脏纤维化相关基因mRNA表达水平显著高于flox/flox小鼠，提示肝纤维化加剧。肝组织切片F4/80免疫组化染色及炎症相关基因mRNA表达检测结果显示，HKO小鼠肝脏炎症反应较对照组更为明显。与flox/flox小鼠相比，HKO小鼠血清ALT和AST水平显著升高，而血清TG水平无显著变化。这些结果表明，肝细胞IL22RA1缺失会促进NASH的发生发展。

图4.肝细胞特异性IL22RA1缺失加重HFD诱导的肝脂肪变性及HFHC饲料诱导的NASH

4.IL-22过表达可诱导肝脏CYP7B1表达，而肝脏IL22RA1缺陷则下调其表达

已证实IL-22过表达可改善肝脂肪变性，而肝细胞特异性IL22RA1缺陷会加重该病变，在此基础上，作者深入探究了IL-22/IL22RA1信号通路调控肝脏脂质代谢的分子机制。为此，对多种动物模型的肝脏组织进行了RNA-seq分析，包括：CD或HFD喂养的AAV-IL-22小鼠与AAV-GFP对照小鼠，以及HFD喂养的HKO小鼠与flox/flox对照小鼠。对以下三组样本的差异表达基因（DEGs）进行了基因本体（GO）分析：CD喂养的AAV-IL-22组与AAV-GFP组、HFD喂养的AAV-IL-22组与AAV-GFP组、HFD喂养的HKO组与flox/flox组。结果显示，在三组样本中，脂质代谢过程均为富集程度最高的生物学过程。研究人员在这三组中分别鉴定出12个、71个和77个与脂质代谢相关的DEGs。值得注意的是，Cyp7b1（编码氧化甾醇7α-羟化酶，该酶是胆汁酸合成替代途径中的关键酶）在三组中均为共同DEG。

随后，研究者在不同动物模型中验证了CYP7B1的表达水平。结果显示，无论是CD还是HFD喂养的AAV-IL-22小鼠，其肝脏中CYP7B1的蛋白和mRNA水平均显著升高，与RNA-seq结果一致。然而，其他胆汁酸合成相关酶的编码基因（如Cyp8b1和Cyp27a1）表达基本未受影响，仅HFD喂养IL-22过表达小鼠肝脏中Cyp7a1 mRNA水平显著升高。相反，与flox/flox对照小鼠相比，无论是CD还是HFD喂养的HKO小鼠，其肝脏CYP7B1表达均显著降低。flox/flox组与HKO组中Cyp7a1、Cyp8b1的表达基本无明显变化，仅CD喂养HKO小鼠肝脏中Cyp27a1 mRNA水平显著下降。此外，胆汁酸合成的关键调控因子——法尼醇X受体（FXR，由Nr1h4编码）和小异源二聚体伴侣（SHP，由Nr0b2编码）的表达水平，在IL-22过表达小鼠和IL22RA1缺陷小鼠的肝脏中与对照组相比均无显著差异。这些数据表明，CYP7B1可能是IL-22信号通路介导肝脏脂质代谢调控的关键靶基因。

图5.IL-22过表达可诱导肝脏中CYP7B1的表达，而IL22RA1缺陷则会降低其表达水平

5.补充CYP7B1可逆转HKO小鼠中HFD诱导的肝脂肪变性

鉴于HKO小鼠肝脏CYP7B1水平降低，研究人员进一步探究补充CYP7B1是否能缓解该模型小鼠中HFD诱导的肝脂肪变性加重。通过AAV8病毒载体（分别携带GFP基因或小鼠CYP7B1基因）感染小鼠，以增强肝脏CYP7B1表达。结果显示，与flox/flox-AAV-NC（阴性对照）组小鼠相比，HKO-AAV-NC组小鼠肝脏CYP7B1表达显著降低，而HKO-AAV-Cyp7b1组小鼠肝脏CYP7B1呈过表达状态。

在HFD喂养条件下，HKO-AAV-Cyp7b1组小鼠体重增长减缓，且在HFD喂养4周后与HKO-AAV-NC组小鼠的体重差异显著，该差异在8周的观察期内持续扩大。两组小鼠肝脏的大体形态（大小和颜色）变化明显，其中HKO-AAV-Cyp7b1组小鼠的肝重、肝脏TG含量及肝重/体重比均显著降低。肝组织切片的油红O染色和HE染色结果证实，HKO-AAV-Cyp7b1组小鼠肝脏脂滴形成显著减少，这与该组小鼠肝脏生脂基因表达受抑制密切相关（相较于HKO-AAV-NC组）。

此外，CYP7B1过表达后，HKO-AAV-Cyp7b1组小鼠的血清ALT水平低于HKO-AAV-NC组，同时胰岛素敏感性和糖耐量显著改善，血清胰岛素水平降低；而血清TG和AST水平无明显变化。这些数据证实，CYP7B1过表达可逆转HKO小鼠的肝脂肪变性，同时提升其胰岛素敏感性和糖耐量。

图6.补充CYP7B1可逆转HKO小鼠中HFD诱导的肝脂肪变性

6.CYP7B1缺失导致的3β-羟基-5-胆甾烯酸（3βHCA）蓄积，会在MPHs及人类肝脏类器官中加速脂肪生成

CYP7B1是胆固醇代谢与氧化甾醇生成过程中的关键酶。本研究探讨了其在HKO小鼠肝脂肪变性中的作用。对flox/flox小鼠（对照小鼠）和HKO小鼠肝组织的氧化甾醇分析显示，主成分分析（PCA）可将两组样本明确区分。在HKO小鼠肝脏中，3βHCA（胆固醇代谢过程中由固醇27-羟化酶CYP27A1催化27-羟基胆固醇转化生成）是所有检测的氧化甾醇中，与flox/flox小鼠相比升高最为显著的一种。CYP7B1可进一步将3βHCA转化为3β,7α-二羟-5-胆甾烯酸。用3βHCA处理MPHs后，细胞TG水平呈非剂量依赖性升高，油红O染色结果也证实了这一现象，其机制与生脂基因表达上调有关。类似地，人类肝脏类器官（HLOs）暴露于3βHCA后脂肪生成增强，Bodipy荧光染料（特异性标记并可视化细胞或组织中的脂质）染色及Western blot结果均验证了该效应。而IL-22处理可显著减弱3βHCA诱导的HLOs脂质合成。重要的是，用3βHCA处理flox/flox小鼠来源的原代肝细胞后，其细胞脂质沉积水平与HKO小鼠来源的原代肝细胞相当。

胆固醇代谢通路可将胆固醇转化为氧化甾醇，后者进一步生成胆汁酸。胆汁酸对脂质、葡萄糖代谢等多条代谢通路具有重要调控作用。为探究胆汁酸在脂质代谢调控中的作用，本研究分析了肝脏IL22RA1缺陷小鼠及IL-22过表达小鼠的血清胆汁酸水平。结果显示，HFD喂养的flox/flox小鼠与HKO小鼠相比，其血清中初级胆汁酸组成、总胆汁酸水平、初级与次级胆汁酸相对丰度、结合型与非结合型胆汁酸相对丰度，以及12-羟基（12OH）与非12-羟基胆汁酸相对丰度均无显著差异。此外，IL-22过表达对CD或HFD喂养小鼠的血清初级胆汁酸组成及水平影响极小。上述结果表明，肝脏IL22RA1缺陷小鼠出现的有害表型，可能与肝脏氧化甾醇（尤其是3βHCA）水平升高相关，而非胆汁酸的作用。

肝X受体（LXRs），尤其是LXR-α（编码基因Nr1h3），是氧化甾醇的关键作用靶点。为探究3βHCA是否通过结合LXR-α调控脂肪酸合成，本研究通过双荧光素酶报告基因实验评估了3βHCA对小鼠固醇调节元件结合转录因子1（Srebf1）基因启动子的转录激活能力。研究表明，LXR-α可与视黄醇X受体α（RXR-α）相互作用形成异源二聚体，该二聚体结合LXR反应元件（LXRE）后调控基因表达。研究人员向人胚肾293T（HEK293T）细胞及小鼠肝癌细胞（Hepa 1-6）中分别转入LXR-α、RXR-α表达质粒及Srebf1（LXR-α的靶基因）报告基因质粒后，结果显示3βHCA可在两种细胞中均诱导LXR-α的转录激活，其效应与合成型LXR-α激动剂T0901317相当。此外，基于Biacore仪器的表面等离子体共振（SPR）技术检测表明，3βHCA对人LXR-α具有较强的结合亲和力（解离常数KD=9.6 μM），显著高于T0901317对人LXR-α的结合亲和力（KD=836 μM）。

为验证LXR-α是否为3βHCA诱导脂肪生成所必需，本研究用LXR-α拮抗剂SR9243处理MPHs。结果显示，SR9243可通过降低生脂相关蛋白表达、减少脂滴数量及降低细胞TG含量，完全阻断3βHCA对脂肪酸合成的促进作用。而IL-22对3βHCA驱动的脂肪生成的抑制效应，与SR9243的作用类似。腺病毒介导的LXR-α敲低实验进一步证实了上述发现：沉默LXR-α可抵消3βHCA诱导的脂肪生成。此外，染色质免疫沉淀（ChIP）实验显示，与flox/flox小鼠相比，HKO小鼠肝脏中LXR-α向Srebf1启动子区域的募集显著增加。综上，这些结果表明LXR-α是3βHCA诱导脂肪生成中不可或缺的关键分子。

图7.3βHCA促进肝细胞内脂肪酸合成

图8.CYP7B1缺失导致的3βHCA蓄积，会加速MPHs及hLOs中的脂肪生成

7.ATF3在HKO小鼠肝脏中抑制Cyp7b1的表达

随后，作者探究了CYP7B1的上游调控因子，发现由Nr0b2编码的非典型核受体——SHP虽已知可影响Cyp7b1表达，但在IL-22过表达或肝脏IL22RA1缺陷后其表达水平未发生改变。因此，研究人员对RNA-seq数据进行全局分析，以筛选调控CYP7B1表达的潜在上游因子。通过分析CD、HFD喂养的IL-22过表达小鼠及HKO小鼠中差异表达的转录因子，鉴定出4个在所有模型中共同重叠的转录因子：Atf3、Srebf1、Nr1i2和Zbtb7c。其中，Atf3和Srebf1在IL-22过表达小鼠与HKO小鼠中呈现相反的基因表达模式；而另外两个转录因子Nr1i2和Zbtb7c则在CD与HFD喂养的IL-22过表达模型间表现出相反的表达趋势。鉴于IL-22在CD和HFD条件下均能减少肝脏TG蓄积，研究者推测目标转录因子的表达应呈现相似趋势。已有研究表明ATF3与肝脂肪变性相关。本研究中，Western blots分析显示，IL-22可降低HFD喂养小鼠的ATF3表达，同时上调CYP7B1表达；相反，与flox/flox对照小鼠相比，HFD喂养的HKO小鼠肝脏中ATF3水平升高，而CYP7B1水平降低。荧光素酶报告基因实验证实ATF3可抑制CYP7B1表达。一致地，对包含206例NAFLD患者肝活检样本的公共转录组数据（GSE135251）分析显示，ATF3与CYP7B1的mRNA表达呈显著负相关。这些数据阐明了ATF3在肝脏中如何作为CYP7B1的转录抑制因子发挥作用。

IL-22主要激活Janus激酶/信号转导和转录激活因子（JAK/STAT）通路。因此，通过荧光素酶报告基因实验验证STAT3是否为Atf3的直接上游调控因子，结果显示在HEK293T细胞中STAT3对ATF3表达具有负调控作用。使用STAT3特异性抑制剂Stattic抑制p-STAT3水平后，MPHs中ATF3蛋白水平升高，并导致脂质蓄积增加，这一效应主要通过促进生脂基因的表达实现。值得注意的是，IL-22处理可逆转PA诱导的p-STAT3水平下调，并抑制PA引起的ATF3表达升高。这表明IL-22通过STAT3抑制ATF3，从而调控肝细胞的脂质稳态，在高能量饮食条件下发挥代谢保护作用。

为明确ATF3在HKO小鼠中的作用，研究人员向HKO小鼠来源的原代肝细胞中导入靶向干扰Atf3表达的腺病毒。结果显示，ATF3敲低可上调CYP7B1表达，降低细胞内TG含量，减少脂滴蓄积，其机制主要与这些MPHs中生脂相关蛋白表达下调相关。这提示，在HKO小鼠来源的原代肝细胞中敲低ATF3可恢复CYP7B1表达，从而减少脂质蓄积。用油酸处理HLOs后，ATF3水平及生脂基因表达均显著升高；而IL-22处理可通过抑制HLOs中ATF3的表达，抵消油酸诱导的生脂基因表达升高的效应。

图9.ATF3在HKO小鼠的肝脏中负调控CYP7B1的表达

图10.STAT3是ATF3调控肝细胞脂肪酸合成的上游信号分子

8.HKO小鼠肝脏中ATF3敲低可减轻肝脂肪变性并改善血糖稳态

为评估ATF3在HKO小鼠中的脂质调控作用，研究者采用AAV8（尾静脉注射）靶向敲低小鼠肝脏中的ATF3表达。结果显示，ATF3敲低可上调CYP7B1表达，降低HKO小鼠的体重、肝重及肝重/体重比。在不影响血清TG水平的情况下，ATF3敲低减轻了HKO-shAtf3小鼠的肝脂肪变性。此外，HKO-shAtf3小鼠的血清ALT和AST水平显著降低，表明与HKO-NC小鼠相比，其肝损伤得到缓解。进一步研究发现，ATF3敲低可改善HKO小鼠的胰岛素敏感性和糖耐量，且HKO-shAtf3小鼠的空腹胰岛素水平降低。这些结果表明，干扰ATF3表达可恢复CYP7B1的表达，从而减轻肝脂肪变性并改善血糖稳态。值得注意的是，无论是敲低ATF3还是过表达CYP7B1，均能将HKO小鼠肝脏中的3βHCA含量降至与flox/flox对照小鼠相近的水平。

图11.在HKO小鼠肝脏中沉默ATF3，可减轻肝脂肪变性并改善血糖稳态

总结

综上，本研究数据表明，肝组织IL22RA1通过ATF3/CYP7B1/3βHCA/LXR-α信号通路调控脂质稳态。本研究揭示了3βHCA的新功能——作为肝细胞脂肪生成的强效激活剂，这一机制可能是肝组织IL22RA1缺陷小鼠肝脏脂质合成异常增加的潜在原因。IL-22可有效抑制3βHCA的生脂效应，表明了IL-22/IL22RA1通路在NAFLD中的治疗潜力。

肝脏IL22RA1缺陷通过3βHCA调控肝脂肪变性的机制模式图

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