当前全世界有数以百万人身患遗传性疾病，治疗性的基因编辑技术能从根本上通过修正缺陷基因彻底治愈遗传性疾病，因此被认为是最有可能攻克遗传疾病的治疗方案。近些年来，科学家开发出一系列强大的基因编辑工具，包括核酸酶编辑技术、碱基编辑技术和引导编辑技术，这些基因编辑技术已经被广泛运用到治疗遗传性疾病的动物模型研究中，其中一些治疗性的基因编辑策略已经进入临床试验阶段。而目前大多数基因编辑的临床试验都是体外基因编辑方案，即从患者体内获得细胞，在体外进行基因编辑，然后重新导入患者体内的治疗方案。但除了干细胞之外，多数细胞类型并不适用于体外基因编辑方案。体内基因编辑方案，即在患者体内直接对细胞进行基因编辑，该方案为治疗遗传疾病提供了新的方向。体内基因编辑疗法有可能治疗许多遗传疾病的根本原因。然而，实现体内基因编辑治疗的前景需要高效和安全的基因递送系统将治疗基因递送到人体相关器官和组织，这是目前体内基因编辑方案的一个重大挑战。

  2022年7月6日美国麻省理工学院-哈佛大学博德研究所Liu DR团队在《Cell》发表最新综述文章“Therapeutic in vivo delivery of gene editing agents”，本文中作者回顾了目前用于体内基因编辑治疗的递送技术，包括病毒载体递送、脂质纳米颗粒（LNP）递送和病毒样颗粒（VLP）递送。前两项技术在近期的临床试验中初获成功，并有潜力在未来成为强大的体内基因编辑疗法。由于没有单个递送模式可能适合于每种可能的应用，研究人员比较了每种方法的优缺点。

一、治疗性的基因编辑工具

1.核酸酶编辑技术

  核酸酶可在基因组DNA的特定位置产生双链断裂，对病变的基因进行修复。目前主要有锌指核酸酶（ZFN）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和RNA引导的CRISPR-Cas核酸酶编辑技术。其中CRISPR-Cas核酸酶编辑技术改变了传统的基因编辑，其原理是crRNA通过碱基配对与tracrRNA结合形成复合物，此复合物引导核酸酶Cas蛋白在与crRNA配对的序列靶位点处剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA（single-guide RNA），足以引导Cas对DNA的定点切割。通过设计出不同的sgRNA就能引导Cas进行基因组切割，而不需要设计出新的Cas蛋白，因此成为基因编辑中使用最广泛的核酸酶编辑技术。

2.碱基编辑技术

  碱基编辑技术（BEs）克服了核酸酶编辑技术的许多限制，通过基因组DNA中的单核苷酸替换实现精确的基因校正，而且不需要形成DNA双链断链。BEs由融合到可编程DNA结合域的DNA修饰酶组成，最早的BEs是胞嘧啶碱基编辑（CBEs），能靶向C、G替换为T、A，完成突变碱基的修复。

3.引导编辑技术

  虽然BEs可以纠正大多数遗传疾病中的单核苷酸突变，但却不能进行多个单核苷酸的替换，也不能介导基因靶向插入或删除。而引导编辑技术（PEs）可对多个单核苷酸进行替换，介导基因靶向插入或删除，并且不会产生DNA双链断裂。PEs由融合到Cas9切口酶结构域的逆转录酶组成，并使用工程化的引物编辑向导RNA（PegRNA）将Cas9切口酶引导到特定的靶点，对感兴趣的特定碱基进行编码。

图1.三类治疗性的基因编辑工具

二、体内基因编辑递送系统的基本特征

  成熟的体内基因编辑递送系统需要克服装载基因的细胞内递送和其他的生物障碍。总的来说，成熟的体内基因编辑递送系统必须有以下特征：（1）在进入细胞之前装载的目的基因必须完整不被破坏；（2）能结合特定的细胞；（3）能穿越靶细胞膜进入细胞质中；（4）将其装载的基因在细胞内释放出来。

图2.体内基因编辑递送系统的基本特征

三、病毒载体递送

  目前全球有1000多项临床试验使用病毒载体将目的基因递送到人体特定的细胞中，临床上大多数体内基因编辑都使用腺相关病毒（AAV），少数研究使用慢病毒或腺病毒。

图3.三种不同的病毒载体递送方式

1.AAV递送

  AAV目前是递送DNA分子治疗药物中最受欢迎的病毒载体，具有良好的安全性，高度生物相容性以及较低的免疫反应。此外，自然条件下不同血清型的AAV衣壳感染不同组织在偏好性上也不尽相同。目前运用于临床的AAV主要是自然条件的AAV，工程化或定向进化的AAV目前很少能进入临床。

2.双AAV策略表达大片段基因

  传统上AAV包装能力较弱，为了解决AAV的包装限制，研究人员将编辑的基因分成两部分，使每一部分都可以单独包装成AAV载体。然后这两个AAV载体同时注射，在两个AAV共同感染的细胞中，全长的基因可通过在DNA、mRNA前体或蛋白质水平上的相互作用机制重组。

3.较小的Cas实现单AAV载体递送

  单AAV载体递送可减少实现基因编辑所需的AAV总的病毒剂量，根据PAM序列的不同，Cas9分为SpCas9（来自化脓性链球菌，基因大小为4.1kb，可识别的PAM序列为NGG）和SaCas9（来自金黄色葡萄球菌，基因大小为3.2kb，可识别的PAM序列为NNGRRT）两种。因此，SaCas9可与一个或两个sgRNA共同装载到单个AAV载体中。目前已经可以实现单AAV载体的SaCas9核酸酶敲除Pcsk9并降低小鼠的血清胆固醇。

4.减少AAV递送后编辑基因的长期表达

  AAV递送最大局限性之一是无法控制其在转导细胞中的表达时长。由于AAV基因组可整合到细胞核，因此递送的基因会长期表达。而此类编辑基因的长期表达，会增加其他类型的非靶标基因被编辑的风险。此外，Cas9的长期表达还会引发免疫反应。为了解决这个问题，目前已经开发出自我失活的AAV载体的CRISPR-Cas9基因编辑系统，该系统针对Cas9酶的引导RNA，将随机缺失引入AAV基因组，只要编辑程序被表达，随着时间的推移，表达的编辑程序将会失活。

四、脂质纳米颗粒（LNP）递送

  LNP递送作为体内基因编辑的非病毒载体方式越来越受到科学界的欢迎。LNP主要用于运输核酸物质，包括siRNAs和治疗性mRNAs。为了将其包裹的核酸物质运送到靶细胞，LNP首先通过内吞作用进入细胞，在内体酸化后通过破坏内体膜分泌出来。LNP通常由四种成分组成：阳离子或可电离脂质、辅助脂质、聚乙二醇（PEG）-脂质和胆固醇。通过改变成分可以产生具有不同性质的LNP。目前LNP已被美国FDA批准用于通过静脉注射向人的肝细胞输送治疗性siRNA。

图4.脂质纳米颗粒递送

1.用于肝脏递送的LNP

  大多数静脉注射的LNP会在肝脏中积累，因为许多LNP在血液中被ApoE脂蛋白包裹，血液流经肝细胞时通过ApoE和肝细胞的LDL（低密度脂蛋白）受体相互作用被肝细胞摄取，因此LNP最常见的用途是将治疗性核酸物质运送到肝脏。通过调整LNP的配方能够有效地包裹不同类型的核酸物质，如mRNAs、siRNAs。通过优化LNP的脂质配方，可以将SpCas9核酸酶的mRNA递送到小鼠肝脏。编码SpCas9的mRNA经过化学修饰，可提高mRNA的稳定性，并减少细胞的先天免疫反应。

2.用于非肝脏递送的LNP

  由于静脉注射的LNPs存在较强的肝脏自然积累效应，要开发出LNP介导的非肝脏的基因编辑靶向递送系统存在较大的挑战性。目前非肝脏递送的LNPs的策略之一，就是通过局部注射替代传统的静脉注射。目前通过局部注射脂质包裹的LNPs，成功在小鼠内耳和视网膜中进行核酸酶编辑和碱基编辑。目前许多实验室致力于开发非肝脏递送的LNPs，其中包括已经实现选择性器官靶向（SORT）的LNP，该方案是通过添加额外的带电荷脂质成分来调节颗粒的内部电荷，发现这种额外成分的电荷和浓度足以将LNP引导到肺或脾，而不会影响小鼠的肝脏。

五、病毒样颗粒（VLP）递送

  VLP被认为是富有前景的药物递送载体。VLP是由携带分子货物的病毒蛋白组成的小型结构，但不包含病毒的遗传物质，也不会引起感染。由于VLP缺乏病毒的遗传物质，它们可能比其他使用实际病毒的递送方法更安全。

1.装载mRNA的VLP

  在VLP中装载mRNA依赖于特定的分子机制，通过该机制，mRNA可以被病毒衣壳蛋白识别，并随后被整合到病毒颗粒中。逆转录病毒RNA基因组包含一个包装信号Ψ，该信号直接将病毒RNA包装成病毒颗粒，因此，设计成包含Ψ的mRNA也同样可以被整合到病毒颗粒中。

2.装载功能蛋白或RNPs（核糖核蛋白）的VLP

  VLP中装载功能蛋白或RNP需要一种在VLP形成时将目标蛋白质定位到VLP中的策略。为了实现这一目标，研究人员将所需的目标蛋白与病毒结构蛋白（gag）融合，这一策略在衣壳自组装过程中将目标蛋白导向病毒颗粒。在大多数情况下，Gag和目标蛋白由一个短肽序列连接在一起，该序列在病毒颗粒成熟后被共包裹的病毒蛋白酶切割，使目标蛋白能够释放到感染细胞中。这种方法已被用于在VLP内装载各种不同功能的蛋白，类似的策略也用来将Cas9核酸酶蛋白包装到VLP中。

图5.病毒样颗粒递送

六、展望和结论

  在人类体内进行治疗性基因编辑的时代已经到来。CRISPR-Cas技术的广泛开发和优化已经产生了强大的基因编辑工具，包括核酸酶编辑、碱基编辑和引导编辑。将这些基因编辑工具与有效的体内递送方案（病毒载体、LNP和VLP）相结合治疗疾病，已经从动物模型的概念验证应用到人类的临床治疗中。在目前的体内给药方式下，基因编辑技术可以很容易地通过静脉注射输送到肝脏细胞，或通过眼内注射输送到视网膜细胞，治疗一系列肝脏或眼科的遗传性疾病。随着更多体内基因编辑疗法的开发，以及未来基因递送技术的进步，将为临床治疗不同器官的遗传性疾病提供可靠的途径和坚实的基础。

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