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文献解读

【客户文章】空军军医大学罗层和武胜昔团队在JCI发文揭示慢性痛与精神障碍共病的细胞外基质新机制

2021-09-02  

      2021年8月2日,空军军医大学基础医学院罗层教授和武胜昔教授团队在国际知名期刊The Journal of Clinical Investigation发表了题为“Extracellular matrix protein laminin β1 regulates pain sensitivity and anxiodepression-like behaviors in mice”研究论文,并受邀发表Video abstract。


      慢性痛是临床上常见的慢性疾病,发病率居高不下,其反复发作、迁延难治的特性使患者长期备受折磨。更为严重的是,持久不愈的慢性痛常常导致高发的焦虑、抑郁等精神障碍。同时,异常的精神障碍又可加剧疼痛的强度和时程,二者相互调控、交互敏化,在疼痛和精神障碍之间形成恶性循环和共病状态,带来治疗难度大、疾病转归差、医疗费用高等窘境,使患者“痛”不欲生。尽管镇痛药和抗抑郁类药物多种多样,然而遗憾的是,由于慢性痛诱发精神障碍共病的发病机制仍未阐明,导致治疗还未取得根本性突破。因此开发一种新的、有效的治疗慢性痛与精神障碍共病的治疗方案仍然是一项重大挑战。

      前扣带回皮层(Anterior cingulate cortex, ACC)的细胞可塑性被认为是介导疼痛感知和情绪情感的关键脑区。但迄今为止,更多的关注点主要集中在细胞内的可塑性机制上,而触发和易化细胞内机制的细胞外变化长期被忽视。细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)不仅作为细胞结构的支架蛋白,同时又是感受和向细胞内传递细胞外信息的特殊的第一信使。层粘连蛋白(Laminin)作为ECM的关键组成部分,其是由α亚基、β亚基和γ亚基构成的异三聚体糖蛋白家族,参与调控多种病理生理过程。课题组前期RNA测序结果显示外周神经损伤诱致慢性疼痛并伴发精神障碍共病发生后,ACC中的Laminin β1(LAMB1)发生显著下调。然而,ACC脑区的LAMB1是否以及如何参与慢性疼痛与精神障碍共病的发生发展,其潜在的细胞外-细胞内的相互作用机制又如何,目前尚不清楚。

      这篇文章中,作者首先利用选择性神经损伤(Spared nerve injury,SNI)建立小鼠神经病理性疼痛模型,在伴发焦虑抑郁样行为后,取其ACC脑区进行了转录组测序分析。发现细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)受体相互作用和黏着斑相关通路差异基因富集的显著程度最高。在ECM相关通路的基因转录水平中,层粘连蛋白β1(Laminin β1,LAMB1)作为一种ECM参与了细胞多种生理和病理进程,在SNI模型中出现了显著下调。并通过转录和蛋白水平检测进一步验证转录组测序结果。以上结果提示,ACC脑区中LAMB1表达下调可能参与了SNI诱致的慢性痛伴发焦虑及抑郁等精神障碍共病的发生。

图1 LAMB1在SNI诱致慢性痛伴发焦虑及抑郁样行为小鼠ACC脑区中的变化


      由于LAMB1可能参与ACC脑区调控慢性痛及伴发负性情绪的作用,作者构建了LAMB1干扰病毒,通过外源阻断其在ACC中的表达,观察对小鼠疼痛阈值及焦虑抑郁样行为的影响。结果发现,LAMB1干扰使小鼠同侧足底机械刺激反应曲线出现明显的左移和上移,且痛觉阈值显著降低,对Sham组和SNI组均有影响。通过高架十字迷宫实验发现,LAMB1抑制后,在小鼠活动总距离没有改变的情况下,Sham组小鼠在开臂中的活动距离明显降低;同时,悬尾和糖水偏好实验也得到了相似的结果,LAMB1干扰增加了Sham组小鼠不动时间,降低了小鼠糖水摄入量。以上结果提示,ACC脑区中LAMB1表达下调,能够加剧并恶化小鼠机械性痛觉反应,并显著诱发小鼠出现焦虑及抑郁样行为。

图2 ACC脑区LAMB1下调对小鼠疼痛阈值和焦虑抑郁样行为的影响


      由于ACC脑区锥体神经元突触可塑性改变被认为是介导神经病理性疼痛和精神障碍共病的重要神经机制之一,同时作为ECM分子的LAMB1与神经突触稳定和可塑性有关,因此,作者通过干扰LAMB1观察ACC脑区锥体神经元结构和功能是否发生改变。高尔基染色显示,敲除LAMB1后,ACC锥体神经元顶树突棘密度增加,长度降低。对不同类型树突刺的进一步分析表明,干扰LAMB1与SNI均使Stubby和Mushroom成熟型突触显著增多。以上结果提示,LAMB1表达对维持ACC脑区锥体神经元顶树突突触结构稳定性发挥着重要作用,表达下调可能导致突触结构重塑。

图3 LAMB1下调对ACC脑区锥体神经元顶树突突触结构的影响


      外周神经损伤导致的痛觉敏化以及负性情绪会引起中枢神经敏化现象,其中,ACC脑区锥体神经元就会表现出超兴奋现象。因此观察LAMB1对ACC锥体神经元兴奋性是否产生影响。作者利用全细胞膜片钳记录技术评估了LAMB1缺失对扣带回突触传递的功能后果。结果发现,敲低ACC中的LAMB1会增加神经元的兴奋性,并增强锥体神经元的突触传递。同时,ACC中LAMB1缺失后,mEPSCs的频率和振幅均增加。这表明LAMB1的缺失通过突触前和突触后两种机制增强了突触的传递。

图4 LAMB1下调对ACC脑区锥体神经元突触功能可塑性的影响


      通过免疫沉淀反应试验和免疫印迹分析,发现ACC脑区中LAMB1缺失导致的突触重塑可能是由于Src依赖的RhoA/ROCK/LIMK信号级联激活引起的,从而导致活性cofilin水平异常下降,最终导致肌动蛋白结构重排。

图5 ACC脑区中LAMB1下调对RhoA/LIMK/Cofilin通路的影响


      考虑到肌动蛋白稳定性对AMPAR膜转运的重要性,作者进一步发现在敲除LAMB1后AMPAR和NMDARs的膜转运增强。观察AMPARs上膜是否影响体内功能,通过对小鼠进行单侧病毒注射同时埋入光纤,带有CaMKⅡ启动子的GCaMP6s表达的绿色荧光病毒分别与带有红色荧光Scramble对照病毒和带有红色荧光shLamb1病毒进行共标,在小鼠注射病毒21 d后,ACC脑区表达shLamb1,小鼠出现了痛觉敏化和悬尾实验中不动时间延长现象。在悬尾实验过程中,利用光纤记录系统记录并分析小鼠在悬尾实验挣扎瞬间的钙信号反应。结果显示,在LAMB1干预后,小鼠在挣扎时表现为较大的钙信号瞬时变化。这一数据表 明,在ACC脑区敲除LAMB1的小鼠中,小鼠出现的痛觉敏化和抑郁样行为可能与ACC神经元活动的异常增加有关。

图6 LAMB1敲低对ACC脑区锥体神经元钙瞬时活动的影响


      最后,作者进一步探究LAMB1是否对神经病理性疼痛和焦虑抑郁样共病行为具有治疗作用。由于LAMB1基因片段太大而无法包装于AAV、LV等病毒中实现外源过表达,因此转向寻求其结合受体Integrin β1的特异激动剂-Pyrintegrin。对SNI模型诱致慢性痛及伴发负性情绪的小鼠ACC脑区给药后,能够显著缓解机械痛觉过敏。同时,在高架十字迷宫实验中,在不影响小鼠活动总距离的情况下,Pyrintegrin显著增加了小鼠在开臂的探索时间和活动距离。悬尾和糖水偏好实验也得到了相似的结果,SNI小鼠给予Pyrintegrin后显著降低了悬尾的不动时间和增加了对糖水的摄入量。以上结果提示,激活LAMB1的结合受体Integrin β1可显著缓解疼痛,并起到抗焦虑和抗抑郁样行为的作用。

图7 Integrin β1激动剂Pyrintegrin对SNI模型伴发慢性痛和焦虑抑郁样行为的作用


      根据本研究的结果,作者提出了如下图所示的调控机制模式图。神经损伤诱致的LAMB1下调通过作用于integrin β1依赖的Src/RhoA/LIMK/cofilin信号通路,调控F-actin细胞骨架发生重排,从而导致突触前递质释放几率增加和突触后树突棘结构重塑,最终诱致ACC锥体神经元的功能可塑性和结构可塑性显著增强,二者协同加剧痛觉敏化和焦虑抑郁样行为共病的发生。行为药理学研究显示激活LAMB1- integrin β1系统可显著缓解神经病理性痛与精神障碍共病的程度。

图8 LAMB1对突触可塑性调控的潜在分子机制


      因此,本研究阐明了LAMB1作为ECM的关键组分在调节疼痛可塑性中的新作用,揭示了细胞外变化传递至细胞内可塑性改变的关键桥梁分子,为神经病理性疼痛和精神障碍共病的治疗提供了新的干预靶点和科学依据。


      研究工作由空军军医大学基础医学院神经生物学教研室独立完成,第一作者为博士研究生李珍珍、韩文娟讲师和孙智川医师,通讯作者为罗层教授和武胜昔教授。罗层教授和武胜昔教授团队长期从事慢性痛及其共病的神经机制与干预新策略研究,研究成果先后发表于Brain, Nat Commun, PLoS Biol, Pain等国际权威期刊,并受邀在Trends Neurosci发表特邀综述。近期发表于Pain的一项研究“Nociceptor-localized cGMP-dependent protein kinase I is a critical generator for central sensitization and neuropathic pain”被推选为“Editor’s choice”,受邀发表Video abstract。该工作第一作者为博士研究生王菲、研究助理马绥斌和八年制学员田志成,通讯作者为罗层教授。


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