神经元网络中的适当动力学依赖于兴奋和抑制之间的平衡相互作用，且抑制性GABA能中间神经元在塑造输出神经元活动和信息处理中起着基础作用。抑制性中间神经元包括具有不同形态、分子特性、内在特性和连接模式的异质细胞群。已被广泛研究的三个主要中间神经元群是表达小白蛋白（PV）的中间神经元、表达生长抑素（SST）的中间神经元和表达血管活性肠肽（VIP）的中间神经元，每一个都在神经回路中具有独特的功能。近些年来，研究者已经发现嗅觉功能的减退和神经退行性疾病之间有一些关系。例如嗅觉减退在很多老年人的退化性的神经疾病中都有出现，比如帕金森病、阿尔茨海默病、路易体痴呆等。在帕金森病领域，嗅觉障碍已经成为公认的可以早于运动症状而提前发生的非运动症状。在嗅球（OB）中，来自感觉神经元的嗅觉信息被传递到僧帽细胞和簇状细胞（mitral and tufted cells，M/Ts），M/Ts将加工处理后的嗅觉信息传递到更高的皮层区域。在皮层中继之前，由M/Ts表征的气味信息被局部抑制性中间神经元强烈而广泛调节，且抑制性中间神经元的数量远远超过主要的僧帽细胞（MCs）。

近来，VIP中间神经元作为皮层回路的关键调节器备受关注，不同于PV和SST中间神经元直接支配和抑制锥体神经元，皮层回路中的VIP中间神经元优先靶向其他中间神经元，导致锥体神经元的去抑制。VIP中间神经元介导的去抑制对包括视觉、体感和前额叶皮层在内的许多区域的皮层功能很重要。除了去抑制，VIP中间神经元也可以直接抑制锥体神经元。然而，目前对OB中的VIP中间神经元的分布、电生理学、突触神经支配及其在气味处理中的作用仍知之甚少。

2022年2月15日，来自徐州医科大学江苏省脑病生物信息重点实验室李安安教授团队在Cell Reports期刊发表了题为“VIP interneurons regulate olfactory bulb output and contribute to odor detection and discrimination”的研究论文，在本研究中，作者探讨了VIP中间神经元与MCs之间的突触联系，并考察了VIP中间神经元在气味表征和嗅觉行为中的作用。发现OB中的VIP中间神经元直接抑制MCs，并在气味检测和辨别行为中起着至关重要的作用。光遗传学激活VIP中间神经元降低了清醒小鼠M/Ts的自发和气味诱发活性。全细胞记录显示，VIP中间神经元通过与MCs的直接抑制性突触连接减少MCs放电。此外，VIP中间神经元的失活导致MCs放电增加，嗅觉功能和气味辨别能力受损。因此，总的来说，这些结果表明了VIP中间神经元控制OB输出并在气味处理和嗅觉行为中发挥关键作用。即VIP中间神经元对OB输出、气味检测和气味辨别做出重要贡献。

1.嗅球VIP中间神经元的突触特性及气味反应特征

研究人员将VIP-Cre小鼠与Cre依赖性tdTomato报告小鼠（Ai27）杂交以荧光标记VIP中间神经元，结果显示，在OB中，表达tdTomato的细胞主要位于小球层（GL）和外丛状层（EPL）。表明OB中的VIP中间神经元主要分布在EPL和GL中。随后使用脑片膜片钳技术记录VIP中间神经元的电生理特性，结果显示刺激僧帽细胞层（MCL）诱发了VIP中间神经元中清晰的EPSC（兴奋性突触后电流），表明EPL中VIP中间神经元接收MCs的兴奋性输入。

接下来，作者检测了VIP中间神经元的气味诱发反应。为记录VIP中间神经元的群体活动，使用纤维光度法利用基因编码Ca2+指示剂GCaMP6s测定清醒头部固定小鼠的Ca2+信号，结果表示气味释放时VIP中间神经元Ca2+信号降低，此外，小鼠显示出抑制性反应。表明VIP中间神经元的气味反应主要是抑制性的。最后，作者比较了不同气味间的VIP中间神经元气味反应，结果表明不同的气味会诱导OB的VIP中间神经元中相似的抑制性反应。

图1. 嗅球VIP中间神经元的突触特性及气味反应特征

2.激活VIP中间神经元减少了清醒小鼠M/Ts自发活动

下一步研究人员关注是否VIP中间神经元可调节M/T细胞活性。记录清醒头部固定小鼠OB中M/T细胞的细胞外单单位活动，以评估M/T细胞的自发活动。结果表示光遗传激活VIP中间神经元降低了M/T细胞的平均放电率。光激活的频率越高，M/T细胞的自发性电活动抑制的比例越高。40 hz时M/T细胞的平均放电率出现明显下降。这些结果表明VIP间神经元的激活降低了清醒小鼠M/Ts的自发活动。

图2. 激活VIP中间神经元抑制M/T细胞的自发电活动

3. 激活VIP中间神经元降低M/T细胞气味诱发反应

作者进一步探究激活VIP中间神经元对气味诱发的M/T细胞活动的影响，使用气味传递系统将特定的气味递送给小鼠，发现气味能够诱发M/T细胞的兴奋性及抑制性反应，但光遗传激活VIP中间神经元降低了气味诱发M/T细胞的兴奋性及抑制性反应比例。信号噪声比（SNR）用于显示气味诱发的放电率变化。SNR范围为-1到1，取值为正值表示兴奋性气味反应，负值表示抑制性气味反应。观察到光遗传激活VIP中间神经元SNR值明显增大。对于气味诱发的兴奋性反应，光激活VIP中间神经元减少M/Ts放电；对于气味诱发的抑制性反应，光激活VIP中间神经元增加M/Ts放电。最后，结果表示光遗传激活VIP中间神经元增加气味诱发的M/T细胞放电率。提示VIP中间神经元激活对气味诱发的抑制性反应的兴奋性作用大于对气味诱发兴奋性反应的抑制性作用。

图3. 激活VIP中间神经元降低M/T细胞气味诱发反应

4.激活VIP中间神经元抑制气味诱发的beta和高频gamma振荡反应

虽然M/T细胞放电提供了气味表征和编码的重要信息，OB中的局部场电位（LFP）振荡，特别是β（15-35 Hz）和高频伽马（65-95 Hz）振荡，反映了大脑区域之间嗅觉信息的局部环路处理和通信。结果显示气味的应用增加了β振荡的功率但降低了高频伽马振荡的功率。而VIP中间神经元的光激活一方面显著降低气味诱发的β振荡的功率，另一方面明显增加气味诱发的高频伽马振荡的功率。综合起来，这些结果表明VIP中间神经元的激活减少β和高频γ波段的气味诱发变化。

图4. 激活VIP中间神经元抑制气味诱发的beta和高频gamma振荡反应

5.VIP中间神经元通过直接突触连接抑制MCs

使用离体脑片膜片钳（全细胞记录）技术研究VIP中间神经元对MC细胞是否存在直接突触联系，光遗传学激活VIP中间神经元，并在河.豚毒素（TTX，电压门控型钠离子通道阻断剂）和4-AP（4-氨.基吡啶，钾离子通道阻断剂）存在下记录MCs的突触后电流。结果显示光诱发的突触后电流被TTX完全阻断，而附加4-AP则可恢复。表明在MCs中记录的突触后电流是由VIP中间神经元和MCs之间的直接突触连接引起的。此外，研究人员还发现 GABAA受体拮抗剂荷包牡丹碱（Bic）可以阻断光诱发的突触后电流。上述这些结果表明VIP中间神经元与MCs之间形成抑制性突触连接，从而抑制OB输出。即嗅球中的VIP中间神经元通过释放GABA递质直接抑制MC细胞。

图5. VIP中间神经元与MCs之间形成抑制性突触连接

6. 失活VIP中间神经元损伤嗅觉功能和气味辨别能力

研究人员首先实验发现化学遗传抑制VIP中间神经元提高MCs的自发放电率，随后进一步研究VIP中间神经元失活对嗅觉行为的影响，利用埋藏食物小球实验（目前常用于检测动物嗅觉功能的行为学检测方法）检测小鼠嗅觉功能，记录找寻食物小球花费的时间，从而判定小鼠是否存在嗅觉功能障碍。结果显示相比于腹腔注射生理盐水组，表达hM4Di小鼠中腹腔注射CNO组找到隐藏在垫层下的食物小球花费的时间更长。但对于垫层表面的食物小球两组耗费的时间无差异。这些结果表明VIP中间神经元失活导致嗅觉功能缺陷。

接下来，研究人员探讨VIP中间神经元失活对气味辨别的影响，进行为期7天的气味辨别实验，包括训练期、测试期（简单任务和困难任务）。训练开始前表达hM4Di小鼠每天注射生理盐水或CNO，训练阶段小鼠接受Go/go任务，即无论哪种类型气味，当气味释放后小鼠在规定时间窗口期内舔水管则能获得水奖励。随后测试阶段小鼠接受Go/no-go任务需要区分两种气味。简单任务中区分S+：乙酸异.戊酯（具有香蕉香味）与S-：2-庚.酮（具有类似梨的水果香味）气味；困难任务中区分S+：乙酸异.戊酯:2-庚.酮=6:4与S-：2-庚.酮:乙酸异.戊酯=6:4气味。当S+存在时，小鼠学会舔水管，而当S-存在时，老鼠学会不舔水管。可能的行为反应包括命中（Hit）、正确拒绝（CR）、误报（FA）和未命中（Miss）。比较CNO和生理盐水组中正确反应小鼠的比例。结果表示CNO组能做出正确反应的小鼠更少。同时，作者还比较了小鼠的反应时间，结果说明第五天CNO组小鼠反应时间明显长于生理盐水组。综上所述，这些结果表明抑制VIP中间神经元损伤小鼠的嗅觉功能和气味分辨能力。

图6. 抑制VIP中间神经元降低小鼠嗅觉功能和气味分辨能力

结论

本文通过光遗传学、化学遗传学、光纤钙记录、在体电生理、脑片膜片钳及行为学检测，发现了嗅球的VIP中间神经元在调节小鼠嗅觉信息表征及嗅觉功能中的重要作用。研究结果一方面有助于理解嗅球内部神经环路对嗅球输出的调控作用及机制，解析嗅觉信息在嗅球中的编码过程，另一方面也为脑内VIP中间神经元的功能提供了新的线索。

模式图：OB中VIP中间神经元与MCs形成直接抑制性突触连接，调节小鼠嗅觉功能（气味检测）和气味分辨能力

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徐州医科大学江苏省脑病生物信息重点实验室李安安教授为本文的独立通讯作者，王德娟副教授、研究生吴晶、刘鹏来为论文的共同第一作者。复旦大学脑科学研究院、医学神经生物学国家重点实验室、脑科学前沿科学中心何苗教授参与本项目研究指导，本科生李晓文和李嘉欣对本研究做出了重要贡献。

通讯作者介绍：

李安安，博士，教授，江苏省特聘教授，博士生导师。2010年7月毕业于中国科学院武汉物理与数学研究所，并留所工作。2012年2月至2015年5月为美国科罗拉多大学医学院博士后。2015年6月起进入徐州医科大学江苏省脑病生物信息学重点实验室工作。2015年12月入选“江苏省特聘教授”。李安安教授在学习和工作期间长期从事感觉神经生物学尤其是嗅觉方向的研究，在细胞外电生理记录、动物嗅觉行为学以及光遗传技术方面积累有丰富的理论和实践经验。

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