原理及应用介绍

外泌体是直径30-150nm的细胞外囊泡（不同文献报道的直径不全相同），含有核酸、蛋白质、脂质等多种生物大分子，几乎存在于所有体液中。

图1. 外泌体示意图（Kalluri R,LeBleu VS.Science.2020.）

外泌体的形成

细胞质膜内陷形成胞内体(endosome)；

胞内体包裹生物大分子内吞；

胞内体多囊泡化；

多囊泡体与细胞质膜融合胞吐释放外泌体。

图2. 外泌体的形成（Kalluri R, LeBleu VS.Science.2020.）

外泌体的分布

图3. 外泌体的分布（Ibrahim A, Marbán E. Annu Rev Physiol. 2016.）

外泌体的功能

参与生殖和发育；

调控免疫效应；

参与代谢性或心血管疾病；

清除神经退行性疾病相关蛋白；

影响肿瘤生长、侵袭和迁移

……

外泌体的主要应用

用作疾病诊断和预后生物标志物（癌症、CNS疾病、心脏病等）；

用作新型治疗剂；

用作潜在给药工具（化学药、核酸、蛋白等）。

外泌体研究方法

体内外功能研究

1.细胞水平

将标记的外泌体加入受体细胞中进行共培养，观察细胞的功能变化，如细胞增殖、迁移与侵袭、细胞凋亡等。

图4. 细胞水平实验（图片来源：Fang T,et al.,Nat Commun.2018.）

2.动物水平

将外泌体注射入动物模型中，观察动物表型变化，检测动物分子、病理等相关指标。

图5. 动物模型实验（图片来源：Fang T,et al.,Nat Commun.2018.）

外泌体示踪

1.染料法

染料PKH-67（green）/PKH-26（red）可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光，主要用于细胞体外标记、体外细胞增殖研究以及体内外的细胞示踪研究。PKH67的体内荧光半衰期为10-12天。相比于PKH-67，PKH-26具有更长的半衰期，标记在兔红细胞上的PKH26半衰期长达100天以上。特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。

DiD/DiO/DiR/DiI是亲脂性膜染料，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色。在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。

图6. 外泌体示踪

2.荧光标记慢病毒法

通过慢病毒载体方法，将CD63，CD81等膜蛋白带上荧光标记，带荧光的膜蛋白会表达至外泌体膜上，便于后续进行观察或其他实验。

图7. GFP-CD63融合蛋白（图片来源：Koumangoye RB,et al.,PLoS One. 2011.）

注意事项

1.样品保存

在提取外泌体之前，长期请保存于-80℃，短期（1-2天）可保存于4℃。尽量用新鲜样本进行提取。

2.血清源外泌体的去除

在细胞培养上清的外泌体提取中，可将细胞培养用血清通过10万g超速离心10小时去除血清外泌体，也可选择无血清培养基进行细胞培养。

3.提取外泌体的保存

纯化后外泌体可于4℃保存不超过一周，-80℃条件下可长期保存。

4.Western blot鉴定

鉴定前，一般按照1:1的比例加入RIPA试剂裂解外泌体。

5.血液样本收集

推荐使用血浆样本提取外泌体，因为血清收集后在凝血过程中，血小板受刺激会产生许多外泌体和其他形式的小泡，因此血浆是研究病理生理状态下外泌体更好的介质。对于涉及到外泌体RNA分离的研究，不能使用肝素或EDTA管去收集血液样本。

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